李莉紅，龐文彪，常凱，閻小艷，高繼萍，宋國華

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原 030001)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)已經(jīng)成為眾多癌癥中最常見的一種頭頸部惡性腫瘤，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，并且趨于年輕化[1]。研究發(fā)現(xiàn)，OSCC的發(fā)生發(fā)展是一個多層面調(diào)控過程，包括從DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及蛋白表達水平都參與病變過程[2]。miRNA不僅與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療及預后密切相關，而且與許多細胞信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)共同構成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，發(fā)揮多種生物學作用，成為近年來腫瘤研究領域的熱點。miRNA與靶mRNA完全或不完全結合在轉(zhuǎn)錄后水平上通過調(diào)控基因的表達、細胞增殖凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程參與口腔癌的發(fā)生發(fā)展[3-5]。因此，為進一步了解OSCC發(fā)生和發(fā)展相關miRNA參與的生物學過程，為疾病的分級、早期診斷及治療提供重要的信息，本文將采用新一代高通量測序技術，構建中國地鼠口腔頰黏膜癌中miRNA和mRNA表達譜，篩選差異表達的miRNA和mRNA并進行二者關聯(lián)分析，探討miRNA在OSCC發(fā)生發(fā)展中的靶向調(diào)控作用，為尋找新的更好的腫瘤標志物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

60只8～10周齡清潔級中國地鼠，雄性，體重 25～35 g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供【SCXK(晉)2015-0001】，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境【SYXK(晉)2015-0001】。隨機分為三組，分別為空白對照組(24只)、溶劑對照組(12只)、模型組(24只)。隔天上午用小頭棉簽在模型組中國地鼠雙側頰囊涂擦0.5% DMBA丙酮液，并禁食禁水2 h。分別在第6、9、12、15周進行處死取頰囊組織，一部分低溫保存，一部分進行病理學檢測。病理學結果詳見文獻[6]。本實驗應用中國地鼠期間按照山西醫(yī)科大學實驗動物管理委員會的要求進行實驗操作，并通過倫理審核。本實驗選取15周鑒定為鱗癌的3個凍存組織和3個正常組織作為本實驗的研究材料。

1.2 方法

1.2.1 構建差異miRNA表達譜

分別從所取得樣本中提取總RNA，經(jīng)質(zhì)檢合格后，對總RNA片段化處理，分離膠技術回收18～35nt的RNA片段，加接頭逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，得到組織樣本的測序文庫。采用Illumina HiSeq 2500 高通量測序平臺[7]對組織樣本的miRNA進行測序，得到原始數(shù)據(jù)之后進行去接頭、去低質(zhì)量以及片段化選擇等處理，獲得目標序列。根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(Release 21)中的基因注釋信息，與已知miRNA進行比對[8]，采用miRDeep2軟件預測新miRNA[9]，構建OSCC組織和正常組織的miRNA表達譜。分別將兩組織的miRNA的表達量歸一化，計算出RPM值(每百萬條測序序列中出現(xiàn)的目標序列的數(shù)量)，比較分析兩組織中顯著差異表達的miRNA [篩選條件：padj<0.05且|log2(Fold Change)|≥ 1 (Fold Change表示鱗癌組和正常組表達量的倍數(shù)變化)]。

1.2.2 構建差異mRNA表達譜

總RNA質(zhì)檢合格后用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，加入fragmentation buffer片段化，用六堿基隨機引物合成cDNA第一鏈，加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA聚合酶I合成cDNA第二鏈，用QIAQuick PCR試劑盒純化后加EB緩沖液、雙聯(lián)cDNA末端修復、加堿基A、加測序接頭、2%瓊脂糖凝膠電泳回收、PCR擴增，得到組織樣品測序文庫。采用Illumina HiSeq 2500 高通量測序平臺提供的PE100測序策略對組織樣本的mRNA進行測序。同miRNA一樣得到Clean Reads后采用TopHat軟件(v2.0.12)[10]和Bowtie2軟件[11]與UCSC (University of California Santa Cruz) 基因組數(shù)據(jù)庫中的Cricetulus griseus參考基因組比對分析，構建mRNA表達譜。分別將兩組織的mRNA的表達量歸一化，計算出RPKM值[12]，采用DEGseq[13]進行基因差異表達分析[篩選條件：P<0.05且|log2(Fold Change)|≥ 1]。

1.2.3 OSCC和正常組織中差異表達miRNA/mRNA對接

應用Gene Ontology功能富集和KEGG Pathway分析，將1.2和1.3的結果關聯(lián)分析，預測與OSCC發(fā)生發(fā)展相關性較高的miRNA和mRNA。

2 結果

2.1 OSCC和正常組織中差異miRNA表達譜

2.1.1 已知miRNA表達譜

對照OSCC和正常組織中已知的miRNA，共有268個miRNA差異表達，其中137個表達上調(diào)，131個表達下調(diào)，結果見圖1所示。進一步對差異miRNA進行深度分析，顯著差異的miRNA共有11個，其中上調(diào)的miRNA有8個，下調(diào)的有3個，具體結果見表1。

2.1.2 新的miRNA表達譜

經(jīng)過分析統(tǒng)計共發(fā)現(xiàn)了208個新miRNA，其中有112個表達上調(diào)，96個表達下調(diào)，結果見圖2。進一步深度分析，得到顯著差異的miRNA共有3個，其中上調(diào)的miRNA有1個，下調(diào)的有2個。與正常組相比，上調(diào)的miRNA有Novel-118，padj(padj為校正之后的P值)為9.63E-06；下調(diào)的有Novel-117和Novel-135，padj值均為0.0412。

表1 口腔頰黏膜鱗癌組織和正常組織中顯著差異表達的已知miRNATab.1 Significant differentially expressed known miRNA between OSCC and normal groups

注：padj為校正之后的P值；Fold Change表示鱗癌組和正常組表達量的倍數(shù)變化。

Note. Padj is the correctedPvalue. Fold change indicates the multiple changes in the expression of OSCC and normal group.

圖1 口腔頰黏膜鱗癌組織和正常組織的差異表達miRNA柱狀圖和餅狀圖Fig.1 Histogram (A) and pie chart (B) of differentially expressed known miRNA between OSCC and normal groups

圖2 口腔頰囊黏膜鱗癌組織和正常組織的新miRNA差異表達柱狀圖和餅狀圖Fig.2 Histogram (A) and pie chart (B) of differentially expressed novel miRNA between the OSCC and normal groups

2.2 OSCC和正常組織中差異mRNA表達譜

對照OSCC和正常組織中的mRNA進行分析，篩選后共檢測出194個基因表達差異，其中128個基因表達上調(diào)，66個基因表達下調(diào)，結果見圖3?？谇活a囊黏膜鱗癌組織和正常頰囊黏膜組織中差異表達前30位的基因見表2。

表2 口腔頰囊黏膜鱗癌組織和正常組織中前30位差異表達基因Tab.2 Differentially expressed genes in the top 30 between OSCC and normal groups

注：CorrectedP-value*為校正之后的P值；Ratio為Fold Change；Fold Change表示鱗癌組和正常組表達量的倍數(shù)變化。

Note. CorrectedP-value* is the correctedPvalue; Ratio is Fold Change; Fold Change indicates the multiple changes in the expression of OSCC and normal groups.

圖3 口腔頰囊黏膜鱗癌組織和正常組織的差異表達基因柱狀圖和餅狀圖Fig.3 Histogram (A) and pie chart (B) of differentially expressed genes between OSCC and normal groups

2.3 OSCC組織中差異表達miRNA/mRNA的對接研究

大量的研究證實，miRNA通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)mRNA降解或抑制其翻譯。據(jù)此，miRNA的表達水平應與其靶mRNA的表達水平相反，利用這一調(diào)節(jié)機制我們將轉(zhuǎn)錄組差異基因庫和miRNA測序獲得的差異的靶基因庫做交集，找出兩庫重合基因，然后根據(jù)上調(diào)miRNA得到下調(diào)差異靶基因，下調(diào)miRNA得到上調(diào)差異靶基因。關聯(lián)分析結果表明，中國地鼠口腔頰囊黏膜鱗癌組織與正常組織中顯著差異表達的11個 miRNA 中有8個關聯(lián)到差異靶基因，其中有 5 個 miRNA 上調(diào)(cgr-miR-21-3p，cgr-miR-34b-5p，cgr-miR-542-3p，cgr-miR-130-3p，cgr-miR-34c-5p)，3 個 miRNA 下調(diào)(cgr-miR-499-5p，cgr-miR-486-3p，cgr-miR-504)。

但是，由于miRNA 與mRNA靶向調(diào)控關系是一對多，多對一的關系，即單個miRNA 可以靶向調(diào)控多個基因，多個miRNA靶向調(diào)控某個基因，因此，并不是上調(diào)的每個miRNA所靶向的每個基因都是呈現(xiàn)低表達，下調(diào)的每個miRNA所靶向的每個基因都是呈現(xiàn)高表達。最終，我們得到靶向調(diào)控的5個基因下調(diào)(Ttn，Ryr1，Tgm7，Pfkm，LOC100766767)，靶向參與上調(diào)的基因有 14 個(Slc1a1，Islr2，Hoxa1，Thbs1，Inhbb，Palm，Gpr176，F(xiàn)kbp10，F(xiàn)am71f2，C1qtnf6，Krt19，LOC100767496，LOC100765213，LOC100762478)(如圖4所示)。因新預測出的顯著差異的miRNA在與基因進行關聯(lián)分析時未發(fā)現(xiàn)靶基因，故后續(xù)不再研究。

圖4 顯著差異表達的已知miRNA及其差異表達靶基因統(tǒng)計Fig.4 Summary of significantly differentially expressed miRNA and its differentially expressed target genes

進一步根據(jù)顯著差異表達的miRNA和基因表達的相關性構建miRNA-基因作用網(wǎng)絡(如圖5所示)。橢圓形表示基因，菱形表示miRNA，相互作用用直線表示。

3 討論

圖5 顯著差異表達miRNA與差異表達靶基因的通路圖Fig.5 Pathway map between significantly differentially expressed miRNA and differentially expressed target genes

OSCC是一種嚴重威脅生命的惡性腫瘤。由于廣泛危險因素的聯(lián)系，以及不可預測的治療結果使OSCC成為最復雜的癌癥之一。目前盡管已有許多治療方式，但是在過去的40年里，OSCC患者的5年生存率并沒有超過50%[14-15]。大量的證據(jù)表明，miRNA不僅可以作為癌癥的診斷和預后標記，而且還能提供靶向治療的靶點[16]。其在轉(zhuǎn)錄后水平上使靶mRNA降解，也可以與靶mRNA不完全互補在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其表達[17]。新一代高通量測序技術是近十年來逐步從新技術成長為主流的測序技術，以其簡單、快速、高分辨率和高通量的特點，在腫瘤研究領域得到廣泛應用[18]，但是在口腔癌的研究中應用鮮少。本研究首次在中國地鼠中成功構建口腔頰黏膜癌miRNA和mRNA的表達譜，對研究口腔頰黏膜癌機制具有參考意義。

大量研究表明，miRNA通過靶向mRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在許多腫瘤中miR-21[19]，miR-130[20]，miR-142[21]表達上調(diào)，而miR-486[22]表達下調(diào)。我們此次miRNA測序結果顯示，cgr-miR-21-3p、cgr-miR-21-5p、cgr-miR-130b-3p、cgr-miR-142-5p表達量升高，cgr-miR-486-3p降低，與口腔黏膜正常組織比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這充分顯示與OSCC相關的miRNA的表達水平與已有研究一致，證實了測序結果可信。在轉(zhuǎn)錄組測序中，我們得到了194差異表達的基因。從前30位差異表達的基因看出，這些基因主要是促炎與抗炎因子、促瘤與抑瘤因子，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族中的MMP9、MMP13在多項口腔鱗癌研究中已經(jīng)證實顯著高表達[23-24]；趨化因子CXCL2、CXCL3由Peng[25]在大鼠口腔鱗癌微陣列芯片分析中檢測出顯著高表達。這些研究表明：與口腔癌相關的差異表達基因的表達水平與本實驗一致，在OSCC的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。

從聯(lián)合分析的結果來看，一個miRNA可調(diào)控多個靶基因，如：cgr-miR-21-3p、cgr-miR-542-3p、cgr-miR-34c-5p、cgr-miR-486-3p、cgr-miR-504。同樣，一個基因被多個miRNA調(diào)控，如：Ttn、C1qtnf6、Ryr 1。據(jù)報道，功能失調(diào)的miR-21-3p在卵巢癌細胞中通過靶向基因RBPMS、RCBTB1、ZNF608和NAV3促進癌細胞增殖和侵襲[26-27]。miR-542-3p在結腸直腸癌中靶向基因OTUB1、CTTN抑制腫瘤細胞的增殖、遷移[28-29]。Gandla等[30]研究惡性癌癥疼痛時，深入的生物信息學分析顯示，在miR-34c-5p的高度靶向的目標基因中，有Cav2.3、12 P2rx6、Oprd1和Oprm1。至于miR-486-3p，目前沒有直接的研究指明其在口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用以及如何調(diào)控OSCC機制，但是有肺癌中miR-486-5p通過下調(diào)促癌基因Arhgap5和胰島素生長因子信號轉(zhuǎn)導的腫瘤抑制基因被確定為腫瘤抑制基因，其表達在血漿樣品中也得到驗證[31-33]。MiR-504通過直接結合腫瘤抑制基因TP53的3′-UTR和靶基因FOXP1影響細胞凋亡、細胞周期和細胞的生長[34-35]。以上研究雖未在口腔癌中充分證實，但也暗示出一個miRNA可以調(diào)控多個基因，與我們的實驗結果一致。

Pfhler等[36]研究發(fā)現(xiàn) TTN作為存在于黑色素瘤相關性視網(wǎng)膜病患者的血清抗體中的抗原，是黑色素瘤潛在的生物標記，可能具有致癌作用。C1qtnf6是重組人補體腫瘤壞死因子相關蛋白6，在卵巢癌患者血清和卵巢癌細胞系中表達顯著下調(diào)，C1qtnf6可抑制 IL-8 /VEGF通路從而抑制卵巢癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[37]。蘭尼堿受體1 (ryanodine receptors 1, Ryr 1)是一種同種四聚體鈣離子通道蛋白，有學者采用基因沉默技術，使肺癌細胞中的 Ryr1基因表達下調(diào)，證實Ryr1基因沉默可使細胞增殖能力下降，使細胞凋亡率顯著增高，進而證實Ryr1基因沉默可使肺癌細胞生物學活性減低，使腫瘤的生長受到抑制[38]。雖然目前還沒有基因Ttn、C1qtnf6、Ryr1被多個miRNA調(diào)控的報道，但是已有許多生物測序?qū)嶒炄纾毫谓尩萚39]在冠心病血瘀證相關lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡研究時得到，基因CTSB可以被hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-106b-5p和hsa-miR-20b-5p調(diào)節(jié)，而RTKN2可被hsa-miR-3158-3p和novel-m9052-5p調(diào)控，暗示我們的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡分析選出的基因Ttn、C1qtnf6、Ryr1被多個miRNA調(diào)控的結果是可信的。

本實驗通過對OSCC和正常組織中miRNA和mRNA表達譜的建立以及二者聯(lián)合分析，使我們更加深入的了解到：一個miRNA可調(diào)控多個mRNA，同時一個mRNA可由多個miRNA調(diào)控，它們相互作用形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，在口腔癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，為口腔癌的發(fā)生、發(fā)病機制，及臨床治療及預后判斷提供理論依據(jù)，同時也為我們篩選口腔癌標志物提供了理論依據(jù)。

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