馮潔，沈志敏，王勝昌，林金杏，柏熊，謝建云*

(1. 上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心，上海 201203； 2. 上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，上海 201203)

東方田鼠(Microtusfortis)在分類學(xué)上隸屬于嚙齒目、倉鼠科、田鼠亞科、田鼠屬，主要分布于我國西北、東北及南方的16個(gè)省區(qū)，在我國存在5個(gè)亞種。東方田鼠是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一具有天然抗血吸蟲病的哺乳動物，其中分布于長江中下游的長江亞種是血吸蟲病流行區(qū)洞庭湖湖區(qū)的優(yōu)勢鼠種，具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1,2]。20世紀(jì)90年代末，上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心和湖南湘雅醫(yī)學(xué)院開始對東方田鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室繁育。飼養(yǎng)的過程中研究人員發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)條件下的東方田鼠易發(fā)生脂肪肝和卵巢癌，可誘發(fā)導(dǎo)致糖尿病等情況[3-5]。為探討不同生存模式下東方田鼠腸道菌群的分布和差異，本文首次采用基于細(xì)菌16S rDNA的高通量測序技術(shù)，對實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)和野外捕捉的東方田鼠腸道菌群多樣性進(jìn)行比較分析，為充實(shí)東方田鼠基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)積累資料，為東方田鼠資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)洞庭湖種群東方田鼠12只，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供【SCXK(滬)2013-0016】，8周齡，體重50～80 g，1998年捕獲于洞庭湖湖區(qū)飼養(yǎng)至今，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施環(huán)境中，室內(nèi)的溫度常年控制在(22±2)℃，相對濕度控制在40%～70%，人工采光，晝夜交替12 h∶12 h。飼料為大小鼠通用飼料，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司生產(chǎn)并提供，自由采食和飲水。野生洞庭湖種群東方田鼠20只，2016年12月捕獲于湖南洞庭湖區(qū)，成年，健康狀況良好，體重約40～70 g，捕獲現(xiàn)場采集腸道標(biāo)本，置于干冰中帶至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑和儀器

細(xì)菌基因組快速提取試劑盒購自Qiagen公司，DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司，PCR擴(kuò)增儀為ABI GeneAmp? 9700 型，測序儀為美國Illumina公司hiseq 2500型。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提

處死動物，用酒精消毒皮膚后解剖，暴露回盲部，取0.2 g回盲部內(nèi)容物，懸浮于1 mL的PBS(pH7.4)中850 g離心5 min，取上清，制成細(xì)菌懸液用于DNA提取?；蚪MDNA抽提操作步驟參照試劑盒說明書。DNA抽提后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

設(shè)計(jì)引物接頭對細(xì)菌的16S rDNA-V4-V5區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收產(chǎn)物后進(jìn)行定量，按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。

1.2.3 Illumina PE250文庫構(gòu)建

連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集。經(jīng)氫氧化鈉變性產(chǎn)生單鏈DNA片段。

1.2.4 高通量測序和生物信息學(xué)分析

高通量測序和生物信息學(xué)分析由上海凌恩生物科技有限公司完成。

測序流程如下：DNA片段一端與引物堿基互補(bǔ)，固定于芯片上，另一端隨機(jī)與附近的另外一條引物互補(bǔ)，也被固定形成“橋”。PCR擴(kuò)增產(chǎn)生DNA簇，激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列所聚合上的核苷酸種類。統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號，即可獲知模板DNA片段序列。

對所有有效序列進(jìn)行質(zhì)控過濾，舍棄低質(zhì)量序列。利用軟件將相似度大于0.97的序列歸為1個(gè)操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)，統(tǒng)計(jì)各樣品所含OTU的數(shù)量，去除無法分類的OTU后進(jìn)行后續(xù)分析，繪制稀疏曲線?；贠TU聚類分析結(jié)果進(jìn)行多樣性指數(shù)分析?；谌郝浣Y(jié)構(gòu)分析，在門和屬兩個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)多樣品的物種分布和豐度差異。

2 結(jié)果

2.1 回盲部內(nèi)容物細(xì)菌物種豐度分析

將序列按相似性進(jìn)行OTU劃分，繪制稀疏曲線(圖1)?？傮w趨勢體現(xiàn)為：序列數(shù)<10 000時(shí)OTU數(shù)量隨著樣本序列數(shù)的增加而迅速增加，序列數(shù)在10 000～30 000之間時(shí)OTU數(shù)量緩慢增加，之后則趨于平臺期，表明取樣數(shù)量合理，測序充分。

通過樣本的多樣性分析可反映出微生物群落的豐度和多樣性，常用豐富度指數(shù)表示。在OTU水平，各樣本的OTU數(shù)目、豐富度指數(shù)(Chao)、覆蓋率指數(shù)(Coverage)及多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)見表1。Coverage值越高，代表樣本中序列被測出的概率越高。Shannon值越高，代表群落多樣性越高，而Simpson 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。

圖1 各樣本的稀疏曲線Fig.1 Rarefaction curves of the samples

樣品SamplesOUT數(shù)目OTUnumberChaoChao樣品覆蓋率Coverage多樣性指數(shù)DiversityindexShannonindexesSimpsonindexes14685730.9951774.370.029426187230.9937365.060.012936386900.9969574.620.034646317090.9965425.190.011056937760.9964205.120.014164645650.9967624.810.016776157400.9967534.640.026387919040.9972465.050.015497538810.9966055.060.0145106677760.9961995.380.0082118068740.9981795.370.0104126427150.9981495.090.0161136747700.9972635.040.0146147258210.9971165.080.0159156036770.9974864.740.0282167618270.9981865.210.0127177087870.9981554.699.0251186547250.9980104.650.0325195917200.9955315.080.0104206507690.9977154.950.0153214334850.9984254.410.0234225136100.9974694.450.0256234424770.9985454.270.0403244865420.9987744.450.0243254204530.9986224.420.0231264454980.9987183.890.0636274514990.9986184.350.0333284405010.9983344.550.0215294685020.9989524.240.0383304574950.9985034.360.0296314234570.9980993.880.0637324084540.9982584.490.0228

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

將實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)和野外生存的動物樣本OTU在門和屬的水平進(jìn)行歸類分析。如圖2所示，兩組樣本共有的OUT有455個(gè)，各自獨(dú)有的OTU個(gè)數(shù)分別是143和699。

注：紅色：實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)組;綠色：野外生存組。圖2 兩組樣本OTU歸類圖Note. Red: Laboratory feeding group. Green: Wild survival group.Fig.2 OTU classification of the two group samples

圖4 兩組樣本細(xì)菌在屬水平的分布Fig.4 Bacteria composition at genus level of the two groups of samples

在門水平，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)樣本細(xì)菌隸屬12個(gè)門，其中厚壁菌門(Firmicutes)占58.43%、擬桿菌門(Bacteroidetes)占34.76%、螺旋菌門(Spirochaetae)占4.87%，其余9個(gè)門合計(jì)僅占1.95%。野外采集樣本細(xì)菌隸屬14個(gè)門，其中厚壁菌門(Firmicutes)占54.29%、擬桿菌門(Bacteroidetes)占41.56%、螺旋菌門(Spirochaetae)占2.15%，其余10個(gè)門合計(jì)僅占2.00%(圖3)。兩組樣本共有11個(gè)門重疊，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)樣本有1個(gè)獨(dú)有的門，即黏膠球形菌門(Lentisphaerae)，野外生存樣本有3個(gè)獨(dú)有的門，分別是梭桿菌門(Fusobacteria)、奇古菌門(Thaumarchaeota)和未分類的門。在屬水平，兩組樣本共檢測到205個(gè)屬，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)樣本細(xì)菌隸屬125個(gè)屬，野外生存樣本細(xì)菌隸屬192個(gè)屬。其中112個(gè)屬為兩者共有，13個(gè)屬為實(shí)驗(yàn)組獨(dú)有，80個(gè)屬為野生組獨(dú)有(圖4)。

實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)組 野外生存組Laboratory feeding group Wild survival group圖3 兩組樣本細(xì)菌在門水平的分布Fig.3 Bacteria composition at phylum level of the two groups of samples

2.3 物種豐度差異性分析

根據(jù)分類學(xué)組成，對微生物類群進(jìn)行組間比較分析(LEfSe)，即LDA分析(線性回歸分析)，并繪制進(jìn)化分支圖以了解兩組樣本微生物物種的差異[6](圖5)。紅色區(qū)域和綠色區(qū)域分別表示實(shí)驗(yàn)組和野生組，紅色節(jié)點(diǎn)表示在實(shí)驗(yàn)組中起重要作用的微生物類群，綠色節(jié)點(diǎn)表示在野生組中起重要作用的微生物類群，黃色節(jié)點(diǎn)表示在兩組別中均未起到重要作用的微生物類群。當(dāng)LDA值>2，P值<0.05時(shí)認(rèn)為該物種為差異物種，差異組別為兩組中豐度高的一組。結(jié)果顯示，在門的水平，共有5個(gè)門存在差異(表2)；在屬的水平，共有64個(gè)屬存在差異，差異最大的為瘤胃球菌屬。因存在差異的屬較多，僅列出差異值前10的屬(表3)。

圖5 兩組樣本LEfSe分析進(jìn)化分支圖Fig.5 Evolutionary branch cladogram of LEfSe analysis of the two groups of samples

門Phylum豐度Abundance差異組別DifferentialgroupLDA值LDAvalueP值PvalueBacteria.Tenericutes軟壁菌門0.0091YSC3.390.047Bacteria.Elusimicrobia迷蹤菌門0.0017SYC2.940.0036Bacteria.Deferribacteres脫鐵桿菌門0.0015YSC2.840.045Bacteria.Lentisphaerae黏膠球形菌門0.00023SYC2.690.000001Bacteria.Verrucomicrobia疣微菌門0.0004SYC2.650.00063

表3 兩組樣本在屬水平的豐度差異分析Tab.3 Differential analysis of genus abundanceof the two groups of samples

3 討論

隨著近年來對腸道菌群研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)腸道微生物對宿主健康起重要作用。臨床上許多重要疾病的發(fā)生、發(fā)展都與腸道微生物的組成以及數(shù)量的增減有密切的關(guān)系。結(jié)構(gòu)異常的腸道菌群很可能是肥胖、高血壓、糖尿病等慢性病的直接誘因。研究表明，動物消化道中存在著種類繁多、數(shù)量龐大的微生物，它們是宿主機(jī)體重要的組成部分，參與腸道發(fā)育、營養(yǎng)吸收、能量代謝、免疫應(yīng)答等生理活動[7-9]。腸道菌群組成的影響因素眾多，主要包括宿主自身的因素和外部環(huán)境的影響。16S rDNA基因存在于所有細(xì)菌的基因組中，具有高度的保守性和特異性，并且該基因序列足夠長(包含約50個(gè)功能域)。隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)及核酸研究技術(shù)的不斷完善，16S rDNA基因檢測技術(shù)已成為病原菌檢測和鑒定的一種強(qiáng)有力工具[10-11]。

本研究通過對洞庭湖種群東方田鼠腸道樣本的細(xì)菌16S rDNA V4-V5可變區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增，并利用高通量測序技術(shù)和序列比對，對實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)和野外生存的東方田鼠腸道菌群的分布特點(diǎn)和差異進(jìn)行分析。兩組樣本的稀疏曲線表明取樣合理，高通量測序深度充分。在門水平比較發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的分布和占比基本相似，豐度最高的為厚壁菌門，其次為擬桿菌門，這兩類微生物對于機(jī)體健康有深遠(yuǎn)的影響，在纖維物質(zhì)消化和脂肪沉積中起主要作用。豐度差異上比較發(fā)現(xiàn)，野外的東方田鼠軟壁菌門、脫鐵桿菌門的豐度較實(shí)驗(yàn)組高。在屬水平上，野生的東方田鼠腸道細(xì)菌較實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的豐富。兩組動物差異顯著的菌群主要為參與消化道能量代謝和吸收的細(xì)菌，如瘤胃球菌與纖維素的附著程度和消化率有重要關(guān)聯(lián)，普雷沃菌是一種纖維降解菌，能產(chǎn)生木聚糖酶，擬桿菌在分解多糖提高營養(yǎng)利用率、加快腸黏膜的血管形成、維持腸道微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用。研究表明，普雷沃菌和擬桿菌可驅(qū)動胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良，引起糖尿病、高血壓等疾病[12]。而嗜膽菌屬在健康機(jī)體腸道中豐度極低，動物性食物、脂肪含量高的飲食可增加膽汁的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致嗜膽菌屬的增加。非酒精性脂肪肝引起的代謝綜合征也有類似情況出現(xiàn)。上述發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探討實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)東方田鼠易發(fā)脂肪肝、糖尿病的機(jī)制提供了一個(gè)思路。

通過對食草動物、食肉動物和雜食動物的腸道菌群組成比較發(fā)現(xiàn)，食草動物為了消化復(fù)雜的含纖維素食物，腸道菌群多樣性程度遠(yuǎn)高于雜食和食肉動物，說明在宿主和腸道菌群協(xié)同進(jìn)化過程中，飲食結(jié)構(gòu)對菌群結(jié)構(gòu)影響非常明顯[13]。東方田鼠是以取食植物綠色部分為主的草食性嚙齒動物，野外生存時(shí)植物莖、葉在東方田鼠的食物組成中占絕對優(yōu)勢[14]。實(shí)驗(yàn)室條件下人工喂養(yǎng)的鼠飼料營養(yǎng)成分雖參照動物的生理特性進(jìn)行制作，但與野生鼠覓食的情況仍有差異，且動物活動受限，能量需求較野生鼠也發(fā)生變化。我們推測，為了適應(yīng)不同的環(huán)境，動物的生物學(xué)特性及代謝規(guī)律形成各自的規(guī)律和特點(diǎn)，這也是導(dǎo)致腸道菌群差異的主要原因。

本文對東方田鼠腸道菌群進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)不同的生活環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)會對機(jī)體腸道微生物的組成產(chǎn)生影響，研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步充實(shí)了東方田鼠基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)，也為東方田鼠在比較醫(yī)學(xué)及腸道微生態(tài)領(lǐng)域的研究開發(fā)提供參考。

(致謝：感謝中國科學(xué)院亞熱帶生態(tài)研究所王勇研究員、李波研究員、張美文研究員以及張琛同學(xué)在東方田鼠采樣過程中提供的幫助！)

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