孟星君，李孝東，劉俊，周康熙，崔慶亞，胡仁萍，閆榮，戴克勝

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇省血液研究所，衛(wèi)生部血栓與止血重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，血液學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 蘇州 215006)

惡性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)是皮膚黑色素細(xì)胞來源的惡性腫瘤，具有轉(zhuǎn)移快、預(yù)后差、生存期短等特點(diǎn)[1]。近年來，我國黑色素瘤發(fā)病率逐年上升，每年約2萬新發(fā)病例，晚期黑色素瘤患者平均生存期短于1年， 5年生存率低于10%[2]。因此，通過構(gòu)建小鼠黑色素瘤模型來研究黑色素瘤的轉(zhuǎn)移和治療具有重要意義。

腫瘤細(xì)胞順利轉(zhuǎn)移，需要經(jīng)歷以下幾個(gè)階段：首先，腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，然后滲入血管系統(tǒng)中，或者通過淋巴結(jié)和淋巴管在體內(nèi)循環(huán)中存活。之后，腫瘤細(xì)胞穿透內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁，遷移到遠(yuǎn)處部位或器官存活并增殖，形成轉(zhuǎn)移灶[3]。人類利用小鼠模型進(jìn)行癌癥研究已有110多年的歷史[4]。目前，國內(nèi)外許多學(xué)者構(gòu)建小鼠黑色素瘤模型，研究腫瘤的轉(zhuǎn)移和治療[5]，但是種瘤部位不同，細(xì)胞接種數(shù)量(105～107)差別很大，腫瘤的生長時(shí)間(1～3周)也不盡相同。本文旨在構(gòu)建一種成熟、可靠的小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型，為相關(guān)科研工作者提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

1.1.1 動(dòng)物

C57BL/6 J雄性小鼠，6～8周齡，體重20～22 g。購于昭衍(蘇州)新藥研究有限公司【SCXK(蘇)2013-0003】，飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)獨(dú)墅湖校區(qū)905 SPF(specific pathogen free，SPF)級動(dòng)物房中【SYXK(蘇)2017-0043】。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號：2016-1000)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10購于中科院細(xì)胞所(目錄號：TCM36)。胎牛血清、HyClone1640培養(yǎng)基均購于Thermo公司(美國)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、無菌離心管均購于Corning公司(美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10，使用HyClone1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)細(xì)胞于5% CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，用無菌PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化細(xì)胞，加入含10% 胎牛血清1640培養(yǎng)基終止消化，用移液管吹打均勻，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至15 mL無菌離心管中，800 r/min離心5 min，棄去上清，加入2 mL培養(yǎng)基，吹打混勻，隨后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107/mL。

1.2.2 細(xì)胞克隆形成

取對數(shù)生長期B16F10細(xì)胞400個(gè)，接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)10 d，除去培養(yǎng)基，無菌PBS洗滌2次，加入2 mL甲醇固定3 min，倒去甲醇，加入Giemsa染液，15 min后，去除Giemsa染液，清水沖洗培養(yǎng)皿，晾干后拍照。

1.2.3 腫瘤模型制備

1)取6～8周齡，雄性小鼠18只，隨機(jī)分三組，每組6只，分別采取尾靜脈注射、腹腔注射和皮下注射，每只小鼠注射100 μL(3×106個(gè)細(xì)胞)黑色素瘤細(xì)胞懸液，飼養(yǎng)2周后，解剖小鼠并觀察黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況。2)取6～8周齡，雄性小鼠18只，隨機(jī)分三組，每組6只，通過尾靜脈分別注射3×106個(gè)細(xì)胞、1×106個(gè)細(xì)胞、3×105個(gè)細(xì)胞，飼養(yǎng)2周后，解剖小鼠并觀察黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況。3)取6～8周齡，雄性小鼠18只，隨機(jī)分三組，每組6只，通過尾靜脈注射1×106個(gè)細(xì)胞，分別于1周、2周、3周時(shí)解剖小鼠，觀察黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)之間采用配對t檢驗(yàn)，P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10的形態(tài)及增殖

小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10是來源于C57BL/6小鼠自發(fā)性腫瘤細(xì)胞，具有增殖快，侵襲性強(qiáng)，成瘤率高等特點(diǎn)，是構(gòu)建腫瘤模型理想的細(xì)胞，也是國內(nèi)外科學(xué)工作者建立腫瘤模型廣泛使用的一種細(xì)胞株[6]。小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10在顯微鏡下呈成纖維細(xì)胞樣(圖1A)，接種少量細(xì)胞，經(jīng)數(shù)天培養(yǎng)，便可形成克隆(圖1B)，由此可見，該細(xì)胞增殖能力很強(qiáng)。

注：A：200倍顯微鏡下對數(shù)生長期B16F10細(xì)胞(右下角紅色標(biāo)尺為5 μm)。B：接種400個(gè)對數(shù)生長期B16F10細(xì)胞至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)10 d后，去培養(yǎng)基，經(jīng)PBS洗滌，甲醇固定后，使用Giemsa染色。圖1 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10的形態(tài)及增殖Note. A: Long-term cultured B16F10 cells growing at logarithmic phase. ×200, Bar=5 μm.B: 400 B16F10 cells growing at logarithmic growth phase were inoculated into the culture dish and cultured for ten days. The culture medium was washed by PBS and fixed by methanol. Giemsa staining.Fig.1 Morphology and proliferation of mouse melanoma B16F10 cells

2.2 不同種瘤部位結(jié)果比較

腹腔注射(圖2 A)和皮下注射(圖2B)在原位(接種部位)形成腫瘤，成瘤率為100%，但沒有發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移(圖2C2，2C3)；通過尾靜脈注射黑色素瘤細(xì)胞，發(fā)生明顯的肺部轉(zhuǎn)(圖2C1)，成瘤率為100%。

2.3 接種不同數(shù)量細(xì)胞結(jié)果比較

當(dāng)接種3×106個(gè)B16F10細(xì)胞時(shí)，肺部腫瘤轉(zhuǎn)移灶異常多(圖3A1)，難以準(zhǔn)確計(jì)算轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量；當(dāng)接種1×106個(gè)B16F10細(xì)胞時(shí)，肺部腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量適中(圖3A2)，較易于計(jì)算轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量；而當(dāng)接種3×105個(gè)B16F10細(xì)胞時(shí)，肺部腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量較少(圖3A3)。以上結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3B)。

注：A：腹腔注射3×106個(gè)B16F10細(xì)胞，2周后解剖，紅色圓圈表示腫瘤部位；B：皮下注射3×106個(gè)B16F10細(xì)胞，2周后處死小鼠解剖，紅色圓圈表示腫瘤部位；C1：經(jīng)尾靜脈注射后取出的肺；C2：經(jīng)皮下注射后取出的肺；C3：經(jīng)腹腔注射后取出的肺。圖2 接種不同部位結(jié)果比較Note. A: 3×106 B16F10 cells were injected intraperitoneally and the mice were killed at two weeks after tumor cell inoculation. The red circle indicates the tumor location. B: 3×106 B16F10 cells were injected subcutaneously, and the mice were killed two weeks later. The red circle indicates the tumor location. C1: The lungs taken from a mouse after intravenous injection. C2: The lungs taken from a mouse after subcutaneous injection. C3: The lungs taken out from a mouse after intraperitoneal injection.Fig.2 Comparison of the tumor growth after melanoma cell inoculation through different routes of inoculation

注：A1：接種3×106個(gè)B16F10細(xì)胞；A2：接種1×106個(gè)B16F10細(xì)胞；A3：接種3×105個(gè)B16F10細(xì)胞，種瘤后，均飼養(yǎng)2周，處死小鼠解剖取出肺。B：為統(tǒng)計(jì)圖。****P<0.0001。圖3 接種不同數(shù)量細(xì)胞結(jié)果比較Note. A1: Inoculation with 3×106B16F10 cells. A2: Inoculation with 1× 106B16F10 cells. A3: Inoculation with 3×105 B16F10 cells. The mice were killed and the lungs were taken at two weeks after tumor cell inoculation. B: Statistical chart.**** P<0.0001.Fig.3 Comparison of the results of inoculating different numbers of cells

2.4 腫瘤生長時(shí)間結(jié)果比較

種瘤3周后，解剖小鼠，黑色素瘤細(xì)胞肺部轉(zhuǎn)移數(shù)量多(圖4A1)，小鼠死亡過半(種瘤6只，死亡4只)；種瘤2周后，解剖小鼠，黑色素瘤細(xì)胞肺部轉(zhuǎn)移數(shù)量適中(圖4A2)，小鼠未死亡；種瘤1周后，解剖小鼠，黑色素瘤細(xì)胞肺部轉(zhuǎn)移數(shù)量較少(圖4A3)。以上結(jié)果差異均有顯著性(圖4B)。

注：A1：接種1×106個(gè)B16F10細(xì)胞后，飼養(yǎng)3周，解剖取出的肺；A2：飼養(yǎng)2周，解剖取出的肺；A3：飼養(yǎng)1周，處死小鼠解剖取出的肺。B：為統(tǒng)計(jì)圖。***P<0.001，****P<0.0001。圖4 腫瘤生長時(shí)間結(jié)果比較Note. A1: The lungs of a mouse killed at 3 weeks after inoculation of 3×106 B16F10 cells. A2: The lungs of a mouse killed at 2 weeks after tumor cell inoculation. A3: The lungs of a mouse killed at one week after tumor cell inoculation. B: Statistical chart.***P<0.001,**** P<0.0001.Fig.4 Comparison of tumor growth after different growth time durations

3 討論

大約有90%的腫瘤患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移，影響該過程的因素有很多，包括：遺傳因素、干細(xì)胞、生長因子、血小板、細(xì)胞間的相互作用等[7]。因此，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移對腫瘤的治療具有重大意義。腫瘤動(dòng)物模型在研究人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療中發(fā)揮著不可替代的作用。小鼠作為常見的模式生物，具有繁殖快、飼養(yǎng)方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，為越來越多的科學(xué)工作者所使用。常用的腫瘤模型有三種，分別為：致癌物誘導(dǎo)的腫瘤模型、移植腫瘤模型(包括同種移植和異種移植)和基因工程小鼠模型[8]，然而，建立致癌物誘導(dǎo)的腫瘤模型耗時(shí)周期較長，個(gè)體差異較大。因此，移植腫瘤模型和基因工程小鼠模型應(yīng)用更為普遍。

通過多次嘗試，本文摸索到一種成瘤率高、重復(fù)性好的體外建立小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型方法。實(shí)驗(yàn)證明小鼠黑色素瘤細(xì)胞是通過血液循環(huán)實(shí)現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，皮下注射和腹腔注射在2周內(nèi)均未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移的效率很低，只有不到0.1%的腫瘤細(xì)胞通過循環(huán)系統(tǒng)，最終形成轉(zhuǎn)移灶[3]。這提示可以考慮從血液循環(huán)途徑著手，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。王紅陽等[9]建立小鼠黑色素瘤模型，使用阿司匹林和氯吡格雷成功抑制了黑色素瘤細(xì)胞的肺部轉(zhuǎn)移。聶廣軍等[10]利用納米材料包裹替格瑞洛后注射荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物能抑制腫瘤向小鼠肺部轉(zhuǎn)移。同樣，基因工程小鼠模型也有廣泛應(yīng)用，Camerer等[11]利用小鼠黑色素瘤細(xì)胞，尾靜脈注射到PAR基因敲除小鼠中，發(fā)現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移較野生型明顯減少。Jain等[12]發(fā)現(xiàn)，GPIbα基因缺失小鼠，經(jīng)尾靜脈注射小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10后，肺部轉(zhuǎn)移較野生型小鼠減少約15倍。Terranbe等[13]發(fā)現(xiàn)，vWF基因缺失小鼠，在腫瘤模型試驗(yàn)中，肺部轉(zhuǎn)移較野生型小鼠顯著增加。高苒等[14]將小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10接種到綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠皮下，成功建立了GFP小鼠腫瘤模型。

此外，本研究還嘗試過通過眼內(nèi)眥靜脈叢注射的方式建立腫瘤模型，結(jié)果注射后幾分鐘，小鼠均死亡?？赡艿脑蚴牵鹤⑸湫∈蠛谏亓黾?xì)胞后，大量細(xì)胞在小鼠眼球內(nèi)形成栓塞，堵塞血管，導(dǎo)致小鼠死亡。因此，不推薦該方法。當(dāng)然，如果只是建立普通腫瘤模型，使其形成原發(fā)灶，不形成轉(zhuǎn)移灶，通過皮下注射或者腹腔注射是更為簡單的操作方法。趙勇等[15]通過大量實(shí)驗(yàn)，總結(jié)了小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中常見的問題。

綜上所述，尾靜脈注射1×106個(gè)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10，生長2周時(shí)間，為構(gòu)建C57BL/6 J小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型的推薦方法。

(致謝：感謝沈瑩、沈飛老師在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)上給予的幫助和指導(dǎo)。)

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