莫紫梅，楊 黎，鄭娟梅*，陳寧周，王 警

（廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 南寧 530021）

亞硝酸鹽和硝酸鹽常用于肉類腌制，其能保持肉類色澤、抑制微生物的生長(zhǎng)以及產(chǎn)生特殊風(fēng)味[1]。亞硝酸鹽分解形成的一氧化氮與血紅素反應(yīng)生成亞硝基肌紅蛋白，使腌制的肉類呈粉紅色，是肉制品加工的發(fā)色劑，過(guò)量攝入可導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥[2]。亞硝酸鹽與其他鹽類結(jié)合則具有一定的抑菌作用，能夠抑制碎肉罐頭和腌肉中的梭狀芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌等[2-4]。亞硝酸鹽能與食品中的有機(jī)胺類物質(zhì)形成致癌性N-亞硝基化合物[1,3-5]。硝酸鹽在口腔和腸道微生物作用下可轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，亦可形成亞硝胺類物質(zhì)，危害人體健康[1,5]。

GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，熟肉制品中硝酸鈉（或硝酸鉀）的最大使用量為0.5 g/kg，亞硝酸根的殘留量（以亞硝酸鈉計(jì)）≤30 mg/kg，成人攝入亞硝酸鹽0.2～0.5 g就能造成中毒，攝入3 g就可造成死亡[5]。因此對(duì)腌肉制品中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的檢測(cè)和控制非常必要。

目前，測(cè)定亞硝酸鹽和硝酸鹽的方法有氣相色譜法[6]、紫外分光光度法[7-9]、熒光光度法[10]和離子色譜法[11-19]等。離子色譜法操作簡(jiǎn)便、快速、分辨率與準(zhǔn)確度高，可同時(shí)測(cè)定多種離子，目前廣泛應(yīng)用于食品質(zhì)量與安全分析中[17-21]，如測(cè)定食品中的添加劑[22-27]、甜味劑[28-29]及其他組分[30-31]。

本研究采用抑制型電導(dǎo)法檢測(cè)由FAPAS（Food Analysis Performance Assessment Scheme）提供的肉粉樣品中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，以氫氧化鉀緩沖溶液作為淋洗液進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)經(jīng)前處理的樣品進(jìn)樣分析，將樣品中的硝酸根和亞硝酸根與有機(jī)酸及其他常見(jiàn)陰離子進(jìn)行分離。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉粉樣品由FAPAS提供。

亞硝酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度1 000 μg/mL，以） 國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；硝酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度1 000 μg/mL，以NO3－計(jì)）美國(guó)O2si公司；KOH淋洗液 美國(guó)Dionex公司；超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

Dionex ICS-5000＋離子色譜儀（配備Dionex AS自動(dòng)進(jìn)樣器、四元梯度分析泵、淋洗液發(fā)生器、電導(dǎo)檢測(cè)器、AERS 500（4 mm）陰離子抑制器、Chromeleon 7色譜工作站）、X3R高速冷凍離心機(jī)、Dionex OnGuardTMⅡRP柱（1 cc，使用前依次用10 mL甲醇、15 mL水靜置活化30 min）、Dionex OnGuardTMⅡ Ag柱和Dionex OnGuardTMⅡNa柱（均為1 cc，使用前用10 mL水靜置活化30 min） 美國(guó)Thermo Fisher公司；Milli-Q超純水機(jī) 美國(guó)密理博公司；Mettler Toledo XS205DU電子天平（十萬(wàn)分之一） 瑞士梅特勒-托利多公司；S300H超聲波清洗器 德國(guó)Elmasonic公司。

1.3 方法

1.3.1 離子色譜條件

色譜柱為D i o n e x I o n P a cTMA S 1 9陰離子柱（4 mm×250 mm）；保護(hù)柱為Dionex IonPacTMAG19（4 mm×50 mm）；淋洗液為KOH溶液，流速1.0 mL/min，梯度淋洗程序：0～21.0 min，12 mmol/L KOH；21.0～21.5 min，12～40 mmol/L KOH；21.5～27.5 min，40 mmol/L KOH；27.5～28.0 min，40～12 mmol/L KOH；28.0～35.0 min，12 mmol/L KOH；抑制器為AERS 500（4 mm），抑制電流100 mA；電導(dǎo)檢測(cè)器；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量100 μL。

1.3.2 樣品前處理

參照GB 5009.33—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》[18]，稱取1.00 g試樣于150 mL具塞錐形瓶中，加80 mL水，超聲提取30 min，每隔5 min振搖1 次，保持固相完全分散；于75 ℃水浴中加熱5 min，取出放置至室溫，定量轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容，混勻，靜置；將部分溶液轉(zhuǎn)移至100 mL離心管中，于4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液備用。

取上述上清液約15 mL，依次通過(guò)0.22 μm水性濾膜針頭濾器、RP柱、Ag柱、Na柱，流速2 mL/min，棄去7 mL初始洗脫液后，收集洗脫液，注入樣品管中直接進(jìn)行色譜分析。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別取亞硝酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL、硝酸根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL于同一10 mL容量瓶中，用超純水定容，得混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，其中和的質(zhì)量濃度分別為100、500 mg/L。

移取上述混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mL，分別置于100 mL容量瓶中，超純水稀釋，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中的質(zhì)量濃度分別為0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/L，的質(zhì)量濃度分別為0.50、2.50、5.00、10.00、20.00 mg/L。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回收率

將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照優(yōu)化所得色譜條件依次進(jìn)樣分析，以離子的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密稱取樣品1.0 g，加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，按照優(yōu)化所得條件測(cè)定亞硝酸鹽和硝酸鹽的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

考察Dionex IonPacTMAS19、AS15、AS11及AS11-HC 4 種不同柱容量分析柱對(duì)目標(biāo)峰的分離效果。因樣品基質(zhì)復(fù)雜，在亞硝酸鹽色譜峰前后存在未知峰干擾，后經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明為Cl－干擾，Dionex IonPacTMAS19、AS15、AS11色譜柱均能夠達(dá)到分離度要求，綜合考慮峰型對(duì)稱、峰寬拖尾、分離度及分析時(shí)間等因素，選用Dionex IonPacTMAS19柱作為分析柱。Dionex IonPacTMAS19柱能大體積進(jìn)樣，可以將樣品中的亞硝酸根離子和硝酸根離子與其他常見(jiàn)陰離子及有機(jī)酸良好分離，進(jìn)行高濃度樣品分析時(shí)不會(huì)出現(xiàn)過(guò)載和峰拖尾現(xiàn)象，可以使用較高濃度的氫氧根淋洗液，從而擴(kuò)大梯度淋洗范圍，滿足本研究的要求。使用Dionex IonPacTMAS19柱對(duì)樣品進(jìn)行分離的色譜圖如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of standard and sample

2.1.2 淋洗液濃度的選擇

由于肉粉成分復(fù)雜，含有多種陰離子，采用等梯度洗脫難以使各種陰離子達(dá)到良好分離。分別考察12、10、8、6 mmol/L KOH淋洗液對(duì)干擾峰與目標(biāo)峰的影響，最終選擇淋洗液的濃度為：0～21.0 min，12 mmol/L KOH；21.0～21.5 min，12～40 mmol/L K O H；2 1.5～2 7.5 m i n，4 0 m m o l/L K O H；27.5～28.0 min，40～12 mmol/L KOH；28.0～35.0 min，12 mmol/L KOH。在此條件下，目標(biāo)峰與干擾峰能較好分離。

2.1.3 抑制器電流的選擇

抑制器電流會(huì)影響背景電導(dǎo)值，當(dāng)背景電導(dǎo)值在1 μS以下時(shí)，可獲得較好的色譜分析結(jié)果。因此，在上述淋洗液梯度條件下，考察電流強(qiáng)度為60、80、100、120 mA時(shí)背景電導(dǎo)值的大小。結(jié)果表明，抑制器電流為100 mA時(shí)，背景電導(dǎo)值在1 μS以下。

2.1.4 進(jìn)樣量的選擇

考察25、50、100、250 μL的定量環(huán)，考慮到樣品中亞硝酸鹽、硝酸鹽的含量差異以及標(biāo)準(zhǔn)檢出限0.2、0.4 mg/kg的分析要求，最終選擇進(jìn)樣量為100 μL。

綜上所述，確定最佳色譜條件為：色譜柱Dionex Ion PacTMAS19陰離子柱（4 mm×250 mm）；保護(hù)柱Dionex IonPacTMAG19（4 mm×50 mm）；抑制電流100 mA；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量100 μL；流速1.0 mL/min，淋洗液梯度：0～21.0 min，12 mmol/L KOH；21.0～21.5 min，12～40 mmol/L KOH；21.5～27.5 min，40 mmol/L KOH；27.5～28.0 min，40～12 mmol/L KOH；28.0～35.0 min，12 mmol/L KOH。在此條件下，目標(biāo)峰與干擾峰能得到較好分離。

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

肉粉中含有蛋白質(zhì)，能夠水解出對(duì)色譜柱造成污染和傷害的水溶性蛋白質(zhì)，嚴(yán)重影響儀器的使用壽命。因此，樣品在經(jīng)過(guò)RP柱后能有效去除水溶性的大分子物質(zhì)。另外，肉粉、熟肉制品在加工過(guò)程中加入的食鹽等調(diào)料會(huì)干擾被測(cè)離子，特別是亞硝酸根的測(cè)定。因此，本研究采用Ag柱、Na柱，可以有效去除樣品中的金屬離子及氯離子[21]。

比較超聲時(shí)間分別為20、25、30、35 min的效果，結(jié)果表明，超聲時(shí)間為30 min時(shí)，亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量達(dá)到穩(wěn)定，因此選擇超聲時(shí)間為30 min。另外，考察樣品未水浴、75 ℃水浴3 min、75 ℃水浴5 min及75 ℃水浴10 min幾種前處理方式的效果，結(jié)果表明，75 ℃水浴5 min時(shí)，亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量達(dá)到穩(wěn)定，如表1所示。

表1 不同前處理?xiàng)l件下亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量Table 1 Contents of nitrite and nitrate under different pretreatment conditions

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回收率

將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照優(yōu)化所得色譜條件依次進(jìn)樣分析，以離子的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，亞硝酸根和硝酸根的線性方程依次為y=0.865x－0.010、y=0.697x－0.057，相關(guān)系數(shù)均為0.999 9。

由表2～3可知，亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)）的平均回收率為99.53%，RSD=0.60%，硝酸鹽（以NaNO3計(jì)）的平均回收率為99.29%，RSD=0.25%，這表明該測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精密度較好。

表2 亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)）的回收率測(cè)定結(jié)果（n=9）Table 2 Recoveries of nitrite (NaNO2) in spiked samples (n= 9 )

表3 硝酸鹽（以NaNO3計(jì)）的回收率測(cè)定結(jié)果（n= 9）Table 3 Recoveries of nitrate (NaNO3) in spiked samples (n= 9)

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

表4 FAPAS比對(duì)樣品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測(cè)定結(jié)果Table 4 Contents of nitrite (NaNO2) and nitrate (NaNO3) of FAPAS sample determined by ion chromatography

由表4可知，F(xiàn)APAS比對(duì)樣品中亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)）的含量為108.3 mg/kg，硝酸鹽（以NaNO3計(jì)）含量為426.9 mg/kg，而參加此次FAPAS比對(duì)的83 家實(shí)驗(yàn)室的樣品測(cè)定平均值為：亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)）111.0 mg/kg，硝酸鹽（以NaNO3計(jì)）428.0 mg/kg。本次比對(duì)結(jié)果為“滿意”，亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)）測(cè)定結(jié)果偏離Z值為－0.2，硝酸鹽（以NaNO3計(jì)）測(cè)定結(jié)果偏離Z值為0.0（“滿意”要求∣Z∣≤2），表明本研究確定的方法科學(xué)、可靠、精準(zhǔn)。

3 結(jié) 論

本研究采用離子色譜法同時(shí)測(cè)定熟肉制品的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量，所確定的前處理方法能夠有效去除樣品中的無(wú)機(jī)陰離子、陽(yáng)離子及有機(jī)成分的干擾，測(cè)定結(jié)果可靠，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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