劉琨毅，王 琪,*，王 衛(wèi)，袁華偉

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院五糧液技術(shù)學(xué)院，四川 宜賓 644003；2.成都大學(xué) 肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106；3.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644000）

茶多酚具有極強(qiáng)的清除有害自由基的能力以及抑制微生物生長(zhǎng)、消除異味等功能，其抗氧化能力是人工合成抗氧化劑2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tertbutyl-4-methylphenol，BHT）和丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）的4～6 倍，VC的5～10 倍[1-4]。目前，茶多酚以其高效的抗氧化性能及低成本優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、果蔬和罐頭食品中[5-9]。茶多酚不僅具有多種保健功效，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、預(yù)防動(dòng)脈硬化等，而且在人體內(nèi)很快被降解，不會(huì)引起抗藥性問題，也不會(huì)改變?nèi)梭w內(nèi)的正常菌群，是一種安全無毒的食品防腐劑[10-11]。

中式臘腸始創(chuàng)于南北朝以前，因其風(fēng)味鮮美、醇厚濃郁、回味綿長(zhǎng)享譽(yù)海內(nèi)外[12-13]，但含鹽量較高（2%以上）、過于油膩和保質(zhì)期較短等問題在一定程度上影響了傳統(tǒng)中式臘腸的銷量[14-17]。因此，開發(fā)安全性高且有利于健康的低鹽中式臘腸是我國(guó)肉制品的發(fā)展趨勢(shì)[18-20]。為此，本研究在低鹽中式臘腸加工制作過程中添加茶多酚，以期達(dá)到抑制中式臘腸中有害菌的活力及減少有害菌數(shù)量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶多酚（質(zhì)量符合GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[21]中茶多酚的相關(guān)要求）遼寧中科生物工程有限公司；鮮肉及香料 宜賓沃爾瑪超市；人造膠原蛋白腸衣（口徑38 mm） 河北順平腸衣基地；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHs-3c型精密pH計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；BS210S型電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH-ZK型恒溫水浴鍋 上海衛(wèi)凱儀器設(shè)備有限公司；101C-3B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海市崇明試驗(yàn)儀器廠；RS-JR80A型多功能灌腸機(jī) 合肥榮事達(dá)小家電有限公司；XW-80A型漩渦混合器 云南科儀化玻有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中式臘腸制作工藝

原料肉預(yù)處理（茶多酚溶液處理）→絞碎→混合拌料→腌制→灌腸→脫水→風(fēng)干→真空包裝→成品[12,16]。

操作要點(diǎn)：1）將原料豬肉切成8～10 mm的肉丁，放入一定質(zhì)量濃度的茶多酚溶液中，調(diào)整溶液的pH值及溫度后利用恒溫水浴鍋處理一定時(shí)間，然后用純凈水清洗3 次、瀝干水分后待用；2）將原料肉按肥、瘦肉質(zhì)量比為1∶4混勻后斬拌，加入配料（白砂糖7.50%、鹽1.00%、味精0.20%、生姜0.15%、五香粉0.10%）；3）灌注100 g原料肉，單節(jié)臘腸長(zhǎng)度20 cm、直徑4.5 cm，結(jié)扎后于40 ℃條件下脫水24 h；4）15 ℃晾掛風(fēng)干3 d，真空包裝后即為成品[22]。

1.3.2 中式臘腸的菌落總數(shù)測(cè)定

將10 g中式臘腸切片后浸入100 mL蒸餾水中并停留1 min以上，按照ISO 6887-1—2003《食品和動(dòng)物飼料制品微生物學(xué) 試樣準(zhǔn)備及用于微生物檢驗(yàn)的初始懸浮液和10 倍制稀釋液 初始懸浮液和10 倍制稀釋》[23]制備初懸液和10 倍稀釋液。根據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[24]，選取合適稀釋度的稀釋液涂布于平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基平板上[25]，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，進(jìn)行菌落總數(shù)計(jì)數(shù)。

1.3.3 中式臘腸的感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)在學(xué)院食品品評(píng)室內(nèi)完成，邀請(qǐng)13 位教師及實(shí)驗(yàn)員組成評(píng)定小組，明確感官評(píng)定的指標(biāo)和注意事項(xiàng)。參照GB/T 23493—2009《中式香腸》[26]及張培培等[27]對(duì)中式香腸品質(zhì)的研究方法，從外觀、組織狀態(tài)、色澤、香氣、滋味五方面制訂中式臘腸的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示。

表1 中式臘腸感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of Chinese sausages

1.3.4 茶多酚溶液對(duì)中式臘腸原料肉減菌化處理的單因素試驗(yàn)

調(diào)整茶多酚溶液pH值為7.0、控制溶液溫度為28 ℃、處理時(shí)間20 min，茶多酚溶液質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g/100 mL；調(diào)整茶多酚溶液質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL、溶液溫度28 ℃、處理時(shí)間20 min，茶多酚溶液pH值分別設(shè)置為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；調(diào)整茶多酚溶液質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL、溶液pH值為7.0、處理時(shí)間20 min，溶液溫度分別設(shè)置為19、22、25、28、31、34、37 ℃；調(diào)整茶多酚溶液質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL、溶液pH值為7.0、溶液溫度為28 ℃，處理時(shí)間分別設(shè)置為5、10、15、20、25、30、35 min，考察原料肉經(jīng)過不同處理后中式臘腸的菌落總數(shù)及感官評(píng)分。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化中式臘腸原料肉減菌化處理的最佳工藝條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Benhnken[28]的試驗(yàn)次數(shù)較少、周期較短、得到的回歸方程精確度高的特點(diǎn)，以中式臘腸的菌落總數(shù)為指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，采用多元二次方程來擬合試驗(yàn)因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，再通過對(duì)回歸方程的分析[29]確定茶多酚溶液對(duì)中式臘腸原料肉減菌化處理的最佳工藝條件。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用OriginLab OriginPro 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和繪圖；采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 茶多酚溶液質(zhì)量濃度對(duì)中式臘腸原料肉減菌化處理的影響

圖1 茶多酚溶液質(zhì)量濃度對(duì)中式臘腸菌落總數(shù)及感官評(píng)分的影響Fig. 1 Effect of tea polyphenol concentration on total colony number and sensory score of Chinese sausages

由圖1可知，隨著茶多酚溶液質(zhì)量濃度的增加，中式臘腸的菌落總數(shù)隨之降低，當(dāng)茶多酚溶液質(zhì)量濃度為0.8 g/100 mL時(shí)菌落總數(shù)達(dá)到最低，為（5.51±0.08）（l g（C F U/g））。當(dāng)茶多酚溶液質(zhì)量濃度在0.2～0.7 g/100 mL范圍內(nèi)變化時(shí)，中式臘腸的感官評(píng)分隨著茶多酚溶液質(zhì)量濃度的增加顯著增加（p＜0.05），最高可達(dá)（78.3±0.8） 分；當(dāng)茶多酚溶液質(zhì)量濃度繼續(xù)增加至0.8 g/100 mL時(shí)，中式臘腸的感官評(píng)分反而較0.7 g/100 mL時(shí)有所下降，但差異不顯著（P＞0.05）。因此選擇茶多酚溶液質(zhì)量濃度為0.6～0.8 g/100 mL進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 茶多酚溶液pH值對(duì)中式臘腸原料肉減菌化處理的影響

圖2 茶多酚溶液pH值對(duì)中式臘腸菌落總數(shù)及感官評(píng)分的影響Fig. 2 Effect of tea polyphenol pH value on total colony number and sensory score of Chinese sausages

由圖2可知：當(dāng)茶多酚溶液pH值在5.5～7.0范圍內(nèi)時(shí)，中式臘腸的菌落總數(shù)隨著pH值的升高而升高，感官評(píng)分隨著pH值的升高而降低；當(dāng)茶多酚溶液pH值在7.0～8.0范圍內(nèi)時(shí)，中式臘腸的菌落總數(shù)隨著pH值的升高而降低，感官評(píng)分隨著pH值的升高而升高；隨著溶液pH值的繼續(xù)升高，中式臘腸的菌落總數(shù)也隨之升高，但感官評(píng)分則開始下降。這表明茶多酚在弱酸或弱堿條件下表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌能力，中式臘腸的菌落總數(shù)在溶液pH值為8.0時(shí)可降至最低，為（5.43±0.07）（lg（CFU/g））；感官評(píng)分也在溶液pH值為8.0時(shí)達(dá)到最高，為（80.7±0.7） 分。因此茶多酚溶液減菌化處理中式臘腸原料肉的最適pH值為8.0左右。

2.1.3 茶多酚溶液溫度對(duì)中式臘腸原料肉減菌化處理的影響

圖3 茶多酚溶液溫度對(duì)中式臘腸菌落總數(shù)及感官評(píng)分的影響Fig. 3 Effect of tea polyphenol temperature on total colony number and sensory score of Chinese sausages

由圖3可知，隨著茶多酚溶液溫度的逐步升高，中式臘腸的菌落總數(shù)也隨之升高，感官評(píng)分則隨之下降，表明低溫處理對(duì)中式臘腸更為有利。當(dāng)茶多酚溶液溫度為19 ℃時(shí)，中式臘腸的菌落總數(shù)最低，為（4.99±0.04）（lg（CFU/g）），但與溶液溫度為22 ℃時(shí)的菌落總數(shù)（5.03±0.07）（lg（CFU/g））無顯著差異（P＞0.05）；茶多酚溶液溫度為19 ℃及22 ℃時(shí)，中式臘腸的感官評(píng)分也無顯著差異（P＞0.05）。因此選擇茶多酚溶液溫度為19～25 ℃用于后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4 處理時(shí)間對(duì)中式臘腸原料肉減菌化處理的影響

圖4 處理時(shí)間對(duì)中式臘腸菌落總數(shù)及感官評(píng)分的影響Fig. 4 Effect of processing time on total colony number and sensory score of Chinese sausages

由圖4可知，中式臘腸的菌落總數(shù)隨著茶多酚溶液處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，最低為（5.35±0.09）（lg（CFU/g））。當(dāng)茶多酚溶液處理時(shí)間由5 min增加至30 min時(shí)，中式臘腸的感官評(píng)分也隨之增加；但處理時(shí)間為35 min時(shí)，中式臘腸的感官評(píng)分較處理30 min時(shí)有所下降，但無顯著差異（P＞0.05），主要體現(xiàn)在肉質(zhì)的彈性有所下降。因此選擇茶多酚溶液處理時(shí)間為25～35 min用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

利用Box-Benhnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，茶多酚溶液質(zhì)量濃度、溶液pH值、溶液溫度和處理時(shí)間4 個(gè)因素的水平及試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的回歸方程為Y=4.430－0.077A－0.130B－0.093C－0.064D＋0.070AB＋0.110AC＋0.230AD－0.150BD－0.013CD＋0.130A2＋0.220B2＋0.240C2＋0.170D2。

由表3可知，經(jīng)過方差分析，不同試驗(yàn)條件下所得到的菌落總數(shù)回歸方程模型極顯著（p＜0.01），且失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（P＞0.05），表明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢猿浞謹(jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，所得的菌落總數(shù)回歸方程是能夠反映菌落總數(shù)與減菌化工藝各參數(shù)之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，即可以利用此回歸方程確定茶多酚溶液減菌效果的最佳工藝。4 個(gè)因素對(duì)中式臘腸菌落總數(shù)影響的強(qiáng)弱順序依次為溶液pH值＞溶液溫度＞茶多酚溶液質(zhì)量濃度＞處理時(shí)間，其中茶多酚溶液pH值對(duì)菌落總數(shù)的影響極顯著（p＜0.01），茶多酚溶液質(zhì)量濃度和溶液溫度對(duì)菌落總數(shù)的影響顯著（p＜0.05）；且茶多酚溶液質(zhì)量濃度與處理時(shí)間之間具有極顯著交互作用（p＜0.01），溶液pH值與處理時(shí)間之間具有顯著交互作用（p＜0.05）。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fi tted regression model

圖5 兩因素交互作用對(duì)中式臘腸菌落總數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig. 5 Response surface plots for the interactive effect of operating parameters on total colony number of Chinese sausages

響應(yīng)面圖是回歸方程的形象描述，能夠直觀反映各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系以及兩因素間交互作用的類型，進(jìn)而優(yōu)化試驗(yàn)條件[29]。響應(yīng)面圖的曲面坡度越陡峭、等高線越密集成橢圓形，表示兩因素的交互影響越大[30-31]。由圖5可知，茶多酚溶液質(zhì)量濃度與處理時(shí)間之間、溶液pH值與處理時(shí)間之間所形成的響應(yīng)面圖曲面坡度較為陡峭，即因素之間具有較強(qiáng)的交互作用。該結(jié)果與根據(jù)表3的方差分析所得的茶多酚溶液質(zhì)量濃度與處理時(shí)間之間具有極顯著交互作用（p＜0.01）、溶液pH值與處理時(shí)間之間具有顯著交互作用（p＜0.05）的結(jié)論相吻合。

通過軟件分析確定茶多酚溶液對(duì)中式臘腸原料肉最佳減菌化工藝為茶多酚溶液質(zhì)量濃度0.61 g/100 mL、溶液pH值8.35、溶液溫度22.03 ℃、處理時(shí)間33.44 min，在此條件下由公式計(jì)算出的菌落總數(shù)理論值為4.39 （lg（CFU/g））。根據(jù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行3 組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得中式臘腸菌落總數(shù)為（4.35±0.03）（lg（CFU/g）），測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，證明該結(jié)果合理、可靠。

與未經(jīng)過茶多酚溶液處理的原料肉所制成的中式臘腸的菌落總數(shù)（6.91 （lg（CFU/g）））相比，經(jīng)茶多酚溶液最佳減菌化工藝處理后，中式臘腸的菌落總數(shù)下降了33.7%，且符合GB/T 23493—2009《中式香腸》[26]中式香腸菌落總數(shù)應(yīng)低于6.00 （lg（CFU/g））的要求。經(jīng)最佳減菌化工藝處理后，可獲得結(jié)構(gòu)緊致、富有彈性、色澤分明、外表有光澤、臘香味純正、濃郁的低鹽中式臘腸，感官評(píng)分為89.3 分，達(dá)到了在低鹽中式臘腸中添加茶多酚，抑制加工過程中有害菌的活力、減少有害菌數(shù)量及不影響產(chǎn)品感官品質(zhì)的目的。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)利用茶多酚抑制低鹽中式臘腸原料肉中有害菌數(shù)量的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定出的最優(yōu)工藝條件為：將原料肉放入茶多酚質(zhì)量濃度為0.61 g/100 mL的溶液中，調(diào)整溶液的pH值為8.35后利用恒溫水浴鍋在22.03 ℃條件下處理33.44 min，然后用純凈水清洗，3 次瀝干后按肥、瘦肉質(zhì)量比為1∶4混勻后斬拌，加入配料；按照單節(jié)臘腸長(zhǎng)度20 cm、直徑4.5 cm規(guī)格灌注100 g原料肉，結(jié)扎后于40 ℃條件下脫水24 h；然后在15 ℃條件下晾掛風(fēng)干3 d，真空包裝。即可獲得結(jié)構(gòu)緊致、富有彈性、色澤分明、外表有光澤、臘香味純正、濃郁的低鹽中式臘腸，其菌落總數(shù)可降至4.35 （lg（CFU/g））。

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