韓 雪 王 辰 姜 浩 許亦權(quán)

引導(dǎo)骨再生術(shù)(Guided Bone Regeneration，GBR)在醫(yī)學(xué)多學(xué)科領(lǐng)域的應(yīng)用日趨成熟，其完善有賴于膜材料的改進(jìn)和更新。GBR膜按照是否可被吸收而分為兩大類：不可吸收膜和可吸收膜，前者包括聚四氟乙烯膜、鈦膜等，后者包括天然生物膜和合成高分子膜材料。不可吸收膜雖然有較好的生物相容性、細(xì)胞阻隔作用、空間保持作用及臨床可操作性，但需要二次手術(shù)取出，增加了患者的痛苦和療程，中斷了正常的組織愈合過程[1]，同時(shí)因細(xì)胞親和性差導(dǎo)致的創(chuàng)口裂開也增加了感染機(jī)會(huì)。而可吸收膜可避免這些問題的出現(xiàn)[1]。

可吸收性膜最大的優(yōu)點(diǎn)是不用二次手術(shù)取出。可吸收性膜是GBR膜材料研究和應(yīng)用的方向。目前臨床應(yīng)用和研究較多的可吸收性GBR膜材料是膠原膜。膠原纖維具有特有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且無抗原性，可參與愈合過程，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[2]，生物相容性好，可降解吸收、且其產(chǎn)物對(duì)機(jī)體無害。膠原膜的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是暴露后有一定的抗感染能力，所以即使暴露，感染的機(jī)會(huì)也較不可吸收膜少，臨床無需早期取出，對(duì)成骨效率的影響較小，因此在臨床應(yīng)用的范圍越來越廣[3-5]。Patino等[6]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，豬的膠原膜不會(huì)引起局部炎癥反應(yīng)和全身免疫反應(yīng)，在生物醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域有著極廣泛的應(yīng)用前景。但是膠原膜也有一定的局限性，例如大多數(shù)膠原膜較柔軟，難以對(duì)抗外界壓力；而且膠原膜缺乏骨傳導(dǎo)及骨誘導(dǎo)能力。為了進(jìn)一步完善膠原膜的各方面性能，本實(shí)驗(yàn)采用了一種新型礦化膠原膜，將羥基磷灰石和I型膠原相結(jié)合，評(píng)價(jià)該膜作為骨組織再生膜的可行性，本實(shí)驗(yàn)以人骨肉瘤細(xì)胞(Saos-2)為研究對(duì)象，從細(xì)胞水平研究了礦化膠原膜對(duì)其增殖分化的影響，為其臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞Saos-2成骨肉瘤細(xì)胞購(gòu)自協(xié)和細(xì)胞中心。

1.2 主要試劑和設(shè)備 礦化膠原膜(奧精醫(yī)藥科技有限公司，北京)，Bio-gide膜(Geistlich Pharma AG，瑞士)，McCoy培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、雙抗(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京)，MTT(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，平底6孔、24孔板、96孔板(Corning公司，美國(guó))，酶標(biāo)儀(Tecan公司，瑞士)，倒置相差顯微鏡(Leica公司，美國(guó))，熒光倒置相差顯微鏡(Leica公司，美國(guó))，全自動(dòng)生化分析儀(BeckmanAU5821,美國(guó))。

1.3 浸提液的制備 參照ISO0993-5-2009 GB/T醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分細(xì)胞毒性試驗(yàn)體外法，將Bio－gide生物膜和礦化膠原膜按6cm2/mL的比例加入含100mL/L的FBS的McCoy培養(yǎng)液，在37℃、50mL/L的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，用該培養(yǎng)液浸提24h，浸提后0.22μm微孔濾膜過濾除菌，作為實(shí)驗(yàn)組，4℃保存?zhèn)溆?。陰性?duì)照組：10%胎牛血清的McCoy培養(yǎng)液。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) Saos-2細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含有10%胎牛血清的McCoy培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，80%-85%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1∶3比例傳代。

1.5 礦化膠原膜和Saos-2共培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察 將無菌礦化膠原膜放置6孔板內(nèi)，以2.0×105個(gè)/mL密度接種Saos-2于其表面，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液，3天后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并拍照。用PBS將樣品清洗三遍，再使用2.5%的戊二醛將樣品上細(xì)胞固定，置于冰箱保存。染色前，再次用PBS清洗樣品三遍，在各樣品表面滴加50μL羅丹明染料，對(duì)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行熒光染色，避光條件下作用15分鐘，之后使用PBS再次清洗三次，利用熒光顯微鏡獲取細(xì)胞形態(tài)圖片。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，以每孔100μL接種于96孔培養(yǎng)板，使細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)/孔，置于37℃、5%CO2、相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞完全貼壁。棄去培養(yǎng)液，對(duì)照組加入10%胎牛血清的McCoy培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組(Bio-gide和礦化膠原膜組)加入材料浸提液，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)1d、4d、7d、10d時(shí)加入20μL的5mg/mL MTT溶液，繼續(xù)37℃條件下培養(yǎng)4h，然后小心吸去上清液，每孔加入150μL的二甲基亞砜(DMSO)，振搖10min，用酶標(biāo)儀在490nm下檢測(cè)各孔吸光度值(OD)。

1.7 堿性磷酸酶檢測(cè) 以2×104/mL接種于24孔板內(nèi)，每孔1mL，24h待細(xì)胞完全貼壁后，加入上述3組培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)7天后，收集細(xì)胞上清液。全自動(dòng)生化儀檢測(cè)堿性磷酸酶含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，p＜0.05為差異具有顯著性。

2.結(jié)果

2.1 礦化膠原膜與細(xì)胞共培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 Saos-2接種于礦化膠原膜后3d，倒置顯微鏡下可見材料周圍細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖1)，羅丹明染色后熒光顯微鏡觀察Saos-2細(xì)胞在材料表面粘附伸展，呈短梭形，表明細(xì)胞狀態(tài)良好(圖2)。

圖1 倒置顯微鏡下礦化膠原膜周圍細(xì)胞形態(tài)(×40)

圖2 熒光顯微鏡下礦化膠原膜表面細(xì)胞形態(tài)(×100)

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組、Bio-gide組和礦化膠原膜組的吸光度(OD)值見圖3。從圖3可知，將Saos-2在含不同培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)1、4、7、10d，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，三組細(xì)胞數(shù)量不斷增加，1、4、7d時(shí)三組間無顯著性差異(P＞0.05)；10d時(shí)對(duì)照組OD值明顯高于Bio-gide組和礦化膠原膜組，但Bio-gide組和礦化膠原膜組之間無顯著性差異。圖3表明，三種不同培養(yǎng)基均能夠促進(jìn)Saos-2的增殖。同市售Bio-gide組相比，礦化膠原具有同樣良好的細(xì)胞相容性。

圖3 MTT法檢測(cè)三組細(xì)胞吸光度值(*p＜0.05)

2.3 ALP檢測(cè) 如圖4所示，培養(yǎng)7d后，各組培養(yǎng)基中的Saos-2均有ALP的表達(dá)，其中對(duì)照組最低，Bio-gide膜組較高，礦化膠原膜組表達(dá)最高。各組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；說明Bio-gide膜、礦化膠原膜的浸提液相對(duì)于常規(guī)培養(yǎng)條件，均具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的能力，而礦化膠原膜的作用最強(qiáng)。

圖4 Saos-2在各組培養(yǎng)液的ALP活性(*p＜0.05)

3.討論

膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的最重要成分，膠原膜作為GBR膜廣泛應(yīng)用于臨床[7-10]。但膠原膜強(qiáng)度低、無骨誘導(dǎo)活性，為了提高膠原膜的組織修復(fù)再生能力，有必要開發(fā)具有骨傳導(dǎo)和/或骨誘導(dǎo)功能的GBR膜材料，所開發(fā)的新型GBR膜材料應(yīng)該保持膠原膜原有的特點(diǎn)，并且具有一定的機(jī)械強(qiáng)度、骨傳導(dǎo)和/或骨誘導(dǎo)等生物學(xué)功能。羥基磷灰石的成分和結(jié)構(gòu)與骨組織相似，將它與I型膠原結(jié)合制備一種新型可吸收礦化膠原膜[11]，該膜約0.5mm厚，由2層構(gòu)成，光滑層由I型膠原組成，與軟組織相接觸，防止結(jié)締組織長(zhǎng)入；粗糙面由礦化膠原組成，與骨組織相接觸以誘導(dǎo)骨組織再生。本研究觀察人成骨肉瘤樣細(xì)胞Saos-2與該礦化膜共培養(yǎng)的狀態(tài)，以市售膠原膜Bio-gide為對(duì)照，檢測(cè)各組浸提液中細(xì)胞的增殖和成骨分化能力如何，評(píng)價(jià)礦化膠原膜的細(xì)胞相容性，探討其臨床應(yīng)用的可行性。

3d時(shí)礦化膠原膜和Saos-2細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)，光鏡下觀察材料周圍細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好；利用羅丹明染色，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)礦化膠原膜表面的細(xì)胞能夠附著和伸展，細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)良好，呈梭形或多角形，邊界清，胞體飽滿，大小均勻，這說明礦化膠原膜對(duì)Saos-2細(xì)胞無毒性，材料的細(xì)胞相容性良好。

通過MTT法測(cè)OD值，各組細(xì)胞都在增殖，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，1、4、7d時(shí)，各組細(xì)胞無顯著性差異(P＞0.05)，而10d時(shí)作為對(duì)照組完全培養(yǎng)基中細(xì)胞的OD值顯著高于其他兩組實(shí)驗(yàn)組，但兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間無顯著性差異。說明礦化膠原膜與Bio-gide膜對(duì)細(xì)胞的增殖影響一致；其中的確切機(jī)制尚不清楚，但可以說明兩種材料的浸提液微環(huán)境對(duì)細(xì)胞增殖的影響是相似的。

堿性磷酸酶(ALP)是成骨細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，在骨形成過程中從成骨細(xì)胞內(nèi)釋放于細(xì)胞外液，促進(jìn)骨基質(zhì)形成和礦化。本研究中礦化膠原膜浸提液中細(xì)胞外ALP含量明顯高于其他2組，和Bio-gide浸提液相比，差異也具有顯著性，說明實(shí)驗(yàn)組浸提液中特有的羥基磷灰石成分促進(jìn)ALP的分泌。這些結(jié)果與以往研究相一致。Liu等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石與膠原的復(fù)合物可明顯提高細(xì)胞的粘附、增殖和分化[12]。與傳統(tǒng)的膠原膜相比，礦化膠原膜最大的優(yōu)勢(shì)在于疏松層中羥基磷灰石所起的骨再生能力[13]。Imanieh等將犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞與礦化膠原膜體外共培養(yǎng)7天時(shí)，SEM觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，伸出很多偽足并分泌大量基質(zhì)。這說明礦化膠原膜具有良好的誘導(dǎo)犬骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的能力[14]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)鈣、磷、鎂離子在骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化中起重要作用[15]，鈣離子可能促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，ALP表達(dá)量較高，Saos-2細(xì)胞鏡下觀察生長(zhǎng)狀態(tài)良好，增殖正常，與上述結(jié)果一致。這些結(jié)果均證明礦化膠原膜表面適于成骨細(xì)胞附著并能維持其分化功能，具有成骨細(xì)胞的傳導(dǎo)性，可應(yīng)用為引導(dǎo)骨組織再生膜。

礦化膠原膜可以為細(xì)胞提供一個(gè)有利于增殖分化的三維空間結(jié)構(gòu)，為聯(lián)合植骨材料促進(jìn)骨組織再生奠定了良好基礎(chǔ)，但仍需進(jìn)行后續(xù)的蛋白基因檢測(cè)及信號(hào)通路機(jī)制的研究來進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論。

[1] Stoecklin-Wasmer C,Rutjes AW,da Costa BR,et al.Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration：a systematic review[J].Journal of dental research,2013,92(9)：773-781

[2]Naujoks C,Von Beck FP,Langenbach F,et al.Biocompatibility of membranesw ith unrestricted somatic stem cells[J].In Vivo,2013,27(1)：41-47

[3] Gassling V,Purcz N,Braesen JH,et al.Comparison of tw o different absorbable membranes for the coverage of lateral osteotomy sites in maxillary sinus augmentation：a preliminary study[J].Journal of cranio-maxillo-facial surgery：official publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery,2013,41(1)：76-82

[4] Lai CH,Zhou L,Wang ZL,et al.Use of a collagen membrane loaded with recombinant human bone morphogenetic protein-2 w ith collagen-binding domain for vertical guided boneregeneration[J].Journal of periodontology,2013,84(7)：950-957

[5]Lee DW,Kim KT,Joo YS,et al.The Role of Tw o Different Collagen Membranes for Dehiscence Defect Around Implants in Humans[J].The Journal of oral implantology,2015,41(4)：445-448

[6]Patino MG,Neiders ME,Andreana S,et al.Cellular inflammatory responseto porcinecollagen membranes[J].Journal of periodontal research,2003,38(5)：458-464

[7] Stavropoulos A,Chiantella G,Costa D,et al.Clinical and histologic evaluation of a granular bovine bone biomaterial used as an adjunct to GTR w ith a bioresorbable bovine pericardium collagen membrane in the treatment of intrabony defects[J].Journal of periodontology,2011,82(3)：462-470

[8]Kesmas S,Swasdison S,Yodsanga S,et al.Esthetic alveolar ridge preservation w ith calcium phosphate and collagen membrane：preliminary report[J].Oral surgery,oral medicine,oral pathology,oral radiology,and endodontics,2010,110(5)：e24-36

[9] Lee CK,Koo KT,Kim TI,et al.Biological effectsof a porcinederived collagen membrane on intrabony defects[J].Journal of periodontal&implant science,2010,40(5)：232-238

[10]Cardaropoli D,Gaveglio L,Cardaropoli G.Vertical ridge augmentation w ith a collagen membrane,bovine bone mineral and fibrin sealer：clinical and histologic findings[J].The International journal of periodontics&restorative dentistry,2013,33(5)：583-589

[11]王 飄,姚 瑤,趙 皓，等.應(yīng)用齒貝骨粉及礦化膠原膜修復(fù)小型豬拔牙創(chuàng)骨缺損的效果觀察[J].中國(guó)口腔頜面外科雜志,2017,15(5)：408-412

[12]Liu KB,Huang K,Teng Y,et al.Useof mineralized collagen bonegraft substitutes and dorsal locking plate in treatment of elder metaphyseal comminuted distal radiusfracture[J].Front Mater Sci,2014,8(1)：87-94

[13]Sun Y,Wang CY,Wang ZY,et al.Test in canineextraction site preservations by using mineralized collagen plug with or w ithout membrane[J].Journal of biomaterials applications,2016,30(9)：1285-1299

[14]Malathi KG,Dev JN,Kumar KS,et al.A clinical evaluation of a bioresorbable membrane and porous hydroxyapatite in thetreatment of human molar class IIfurcations[J].Journal of Indian Society of Periodontology,2013,17(5)：617-623

[15]Zeng D,Xia L,Zhang W,et al.Maxillary sinusfloor elevation using a tissue-engineered bonew ith calcium-magnesium phosphate cement and bone marrow stromal cells in rabbits[J].Tissueengineering Part A,2012,18(7-8)：870-881