熱孜萬古力·賽買提

陳士恩

高丹丹

武中庸

車敏娜

李明生

(西北民族大學(xué)，甘肅 蘭州 730030)

糖類又稱碳水化合物，是生物體維持生命正?；顒?dòng)所需能量的主要來源，分布于自然界[1]。糖類主要是以單糖、雙糖、低聚糖和多糖4種形式存在。多糖具有降血糖血脂、抗病毒、抗腫瘤、抗感染、抑菌及美白保濕等多種生物活性[2]。多糖的生物活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此研究多糖的單糖組分對研究其生物活性具有重要意義。目前，測定單糖的方法較多，如毛細(xì)管電泳法[3]、高效液相色譜法[4]、氣相色譜法[5]和高效陰離子交換色譜法[6]等，其中高效液相色譜法應(yīng)用最為廣泛[7]。

單糖極性較強(qiáng)，結(jié)構(gòu)相近，且缺乏光學(xué)活性，為了改善其分離選擇性和提高檢測靈敏度需要在檢測前對其進(jìn)行衍生，本文介紹并比較幾種常用單糖分析的高效液相色譜方法，以期為單糖研究提供一定幫助。

1 樣品前處理方法

1.1 柱前衍生

由于糖鏈沒有紫外或者熒光基團(tuán)，無法用紫外檢測器和熒光檢測器直接檢測，單糖的結(jié)構(gòu)限制了檢測模式。折射率檢測等相關(guān)方法往往不能滿足現(xiàn)代的要求關(guān)于靈敏度或選擇性的痕量水平分析，化學(xué)衍生技術(shù)是規(guī)避這個(gè)問題至關(guān)重要的工具。所以檢測前需要對糖進(jìn)行衍生化處理，使糖鏈帶上紫外或者熒光基團(tuán)，極性發(fā)生改變，將難分離的幾種單糖分開，從而更好地檢測出單糖[8-9]。柱前衍生化的優(yōu)點(diǎn)是能選擇反應(yīng)條件、衍生化的副產(chǎn)物能消除其干擾，不需要特定的儀器，成本低，可以選擇多種柱前衍生劑，缺點(diǎn)是產(chǎn)生的副產(chǎn)物可能對色譜分離造成困擾，衍生過程中會(huì)引入一些雜質(zhì)[10]。

柱前衍生法的原理是分析前使分析物與衍生劑反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在分析柱上進(jìn)行分離，實(shí)際上分離檢測的為衍生產(chǎn)物。目前常用的柱前衍生劑有對氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid，PABA)、鄰氨基苯甲酸(O-aminobenzoicacid)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP)、異氰酸苯酯(ABEE)等。

1.1.1 對氨基苯甲酸衍生法 對氨基苯甲酸是苯甲酸的苯環(huán)上的對位被氨基取代后形成的化合物，具有中等毒性。對氨基苯甲酸與單糖反應(yīng)后產(chǎn)生能夠被檢測的物質(zhì)，該方法操作比較簡便，靈敏度較高，可以準(zhǔn)確、快速地檢測出待測樣品，但因?qū)Π被郊姿峋哂卸拘裕瑧?yīng)用較少[11]。葡萄糖與對氨基苯甲酸的反應(yīng)式見圖1。

圖1 葡萄糖和對氨基苯甲酸的反應(yīng)示意圖Figure 1 Schematic representation of the reaction of glucose and p-aminobenzoic acid

郝桂堂等[12]采用2種檢測器分析了9種單糖，并優(yōu)化衍生條件，比較了熒光檢測法和紫外檢測法，發(fā)現(xiàn)采用優(yōu)化的衍生條件處理后51 h內(nèi)，單糖的衍生化產(chǎn)物的峰面積基本不變，測得9種單糖的RSD均<4%，r2>0.997，線性關(guān)系良好，但幾種單糖分離度不好；梁軍等[13]建立了HPLC-FID法檢測酸漿多糖中的單糖成分，進(jìn)行梯度洗脫，幾種單糖的分離效果良好，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性也都良好，用此方法檢測單糖，操作簡單，靈敏度較高，但是操作步驟比較麻煩；Fang等[14]用HPLC-UV法檢測植物細(xì)胞壁上的單糖含量，線性關(guān)系良好，精密度和準(zhǔn)確度較高。

1.1.2 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) 柱前衍生化PMP是目前比較常用的衍生劑，其由苯肼和乙酰乙酸乙酯縮合而成，易溶于甲醇。PMP在堿性條件下與還原糖進(jìn)行反應(yīng)，1個(gè)糖分子還原端可與2分子 PMP 形成穩(wěn)定的衍生物，反應(yīng)結(jié)束后可以用酸中和[15]；衍生產(chǎn)物無立體異構(gòu)體、分離度高、檢測限低。PMP對糖鏈進(jìn)行標(biāo)記的條件很溫和，唾液酸不丟失，對紫外吸收很強(qiáng)，不容易發(fā)生去糖基化現(xiàn)象[16]。

Bai等[17]以PMP作為衍生劑測了單糖與寡糖，回收率為93.13%～102.08%，優(yōu)點(diǎn)是此衍生可以在溫和條件下成功地完成，而不需要高溫和長的衍生時(shí)間，成本較低，適用于普通實(shí)驗(yàn)室檢測；李衛(wèi)燕等[18]建立了柱前衍生化高效液相色譜分析當(dāng)歸酸性多糖中的10種單糖的方法，該檢測方法簡單、高效、準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定，適合測定多種單糖，但pH、流動(dòng)相的比例影響這幾種單糖的分離度；王媛媛等[19]建立了PMP柱前衍生化HPLC分析9種多糖中單糖的成分，對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最優(yōu)的色譜條件，對9種單糖進(jìn)行分離，分離效果良好，r2>0.999，此方法在分析多種單糖中具有顯著的優(yōu)勢，彌補(bǔ)了示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器靈敏度較低的不足；汪名春等[20]分析了萵苣莖水溶性多糖中的8種單糖，其中半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖是主要成分，摩爾比為22.60∶30.42∶17.88，并進(jìn)行了免疫調(diào)節(jié)活性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性；宋葉涵等[21]用氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法分析了鮑魚生殖腺多糖的組成，并進(jìn)行比較，結(jié)果表明高效液相色譜法靈敏度較高，分離效果最好，彌補(bǔ)了氣相色譜法和薄層色譜法分析單糖的缺點(diǎn)；段月等[22]檢測了不同生長期的枸杞多糖中單糖的組成，不同生長期單糖的成分有些差異，其中半乳糖醛酸的含量最高，該方法有效地分離出了幾種單糖，但分離時(shí)間較長。PMP與葡萄糖的反應(yīng)式見圖2。

1.1.3 鄰氨基苯甲酸衍生法 由于鄰氨基苯甲酸具有毒性和刺激性，對環(huán)境和人體具有一定的危害，因此其應(yīng)用較少。國外學(xué)者經(jīng)常以鄰氨基苯甲酸作為單糖的衍生試劑。此試劑具有簡單、易得和靈敏度高的特點(diǎn)[23]。半乳糖與鄰氨基苯甲酸的反應(yīng)式見圖3。

圖2 PMP與葡萄糖的衍生化反應(yīng)Figure 2 Derivation of PMP and glucose

圖3 半乳糖與鄰氨基苯甲酸的衍生化反應(yīng)Figure 3 Derivatization of galactose and O-aminobenzoic acid

程賓等[24]以鄰氨基苯甲酸作為衍生劑，用高效液相色譜法檢測重組人促卵泡激素中的單糖，采用酸水解的方法將各糖分離，鄰氨基苯甲酸衍生化，用熒光法檢測，結(jié)果表明，精密度試驗(yàn)中4種單糖的峰面積RSD分別為0.96%，1.00%，0.83%，0.40%，穩(wěn)定性試驗(yàn)中4種單糖的峰面積RSD分別為1.80%，0.83%，0.18%，1.70%，加樣回收率為98%～104%，此方法重復(fù)性和回收率高。但是對流動(dòng)相的要求比較高，由于衍生劑有毒性，使用范圍較窄，衍生過程中需要嚴(yán)格操作。

1.2 柱后衍生法

柱后衍生化是分離物在分析柱中分離后在衍生池內(nèi)與衍生劑發(fā)生反應(yīng)，在檢測處檢測衍生產(chǎn)物，在柱子內(nèi)分離出來的是目的物。目前關(guān)于柱后衍生高效液相色譜檢測單糖的文獻(xiàn)不多。趙鑫等[25]采用柱后衍生的方法，用高效液相色譜熒光法檢測了4種單糖。結(jié)果表明D-葡萄糖、D-果糖、D-阿拉伯糖、山梨醇4種單糖的檢出限分別為46.880，1.381，3.856，0.921 μg/mL。測定的飲料和蜂蜜樣品的回收率分別為88%～96%，78%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均低于3% (n=6)。此方法具有較高的靈敏度，但因1-萘硼酸具有毒性且衍生方法比較復(fù)雜限制了其應(yīng)用范圍。

柱前衍生成本低，但是衍生過程中會(huì)引入一些雜質(zhì)，影響色譜分離，試驗(yàn)結(jié)果有一定的誤差。柱后衍生法的優(yōu)點(diǎn)是副產(chǎn)物的產(chǎn)生不會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，不需要高的穩(wěn)定性，缺點(diǎn)是需要額外的設(shè)備，成本高，反應(yīng)條件有限。柱前衍生法與柱后衍生法的不同點(diǎn)見表1。

對PMP、p-AMBA、O-aminobenzoic acid 3種衍生劑的反應(yīng)條件進(jìn)行了總結(jié)，見表2。

由表1、2可知，柱前衍生相對于柱后衍生簡單，但是柱前衍生在衍生過程中會(huì)帶入雜質(zhì)，產(chǎn)生誤差。柱后衍生法需要的成本較高。衍生劑中PMP是最理想的衍生劑，沒有毒性，比較安全。

2 液相色譜檢測在單糖分析中的應(yīng)用

2.1 液相色譜示差折光檢測法

示差折光檢測器是根據(jù)流通池內(nèi)的化合物折射率不同的原理而對樣品進(jìn)行檢測。此法是中國測定單糖的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)方法 (標(biāo)準(zhǔn)號：GB 5009.8—2016)。示差折光檢測器是一種高度穩(wěn)定的通用性檢測器[26]，凡是與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分都有響應(yīng)，因此檢測前無需要衍生處理，簡化了操作，提高了效率且能有效分離各種組分，使用范圍也更廣泛[27]。但該方法易受溫度、流動(dòng)相及流速等因素的影響，不可梯度洗脫，靈敏度低[28]。

劉泰然等[29]用高效液相色譜-示差折光檢測法檢測了保健品中的低聚木糖，被檢樣品濃度為0.30～4.50 mg/mL，濃度與峰面積線性關(guān)系良好，精密度、精確度高且排除了干擾試驗(yàn)結(jié)果的因素，但加標(biāo)回收率較低。于雷等[30]建立了同時(shí)檢測懷地黃中反相液相色譜示差折光檢測法，并優(yōu)化了檢測條件，比較了鮮地黃與生地黃中糖類成分和不同品種不同產(chǎn)地的地黃中單糖和低聚糖含量，結(jié)果表明鮮地黃和生地黃中糖類的分布情況有所差異，品種因素和環(huán)境因素對地黃中糖類含量有所影響，該方法不需要對單糖進(jìn)行柱前衍生且分離效果良好；歐陽華學(xué)等[31]用液相色譜示差折光檢測法同時(shí)檢測了枸杞中3種單糖和2種低聚木糖，測得這幾種糖濃度為10.0～400.0 mg/L，與峰面積有良好的線性關(guān)系，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%以下，加標(biāo)回收率為92.27%～101.93%，但此方法中流動(dòng)相的比例對試驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，需要進(jìn)行優(yōu)化；劉瀟瀟等[32]建立了參芪扶正注射液中葡萄糖、果糖和蔗糖的檢測方法，優(yōu)化色譜條件，流速為1 mL/min，溫度為40 ℃，在該條件下，這幾種糖的分離效果較好，精密度、穩(wěn)定性、回收率良好，但此方法中柱子溫度超過室溫，不好控制，而且溫度太高容易出現(xiàn)基線漂移的現(xiàn)象；鄭秀春等[33]采用萊茵-埃農(nóng)氏法和高效液相色譜-示差折光檢測法檢測了奶粉中乳糖和蔗糖，結(jié)果表明HPLC-RID法較為準(zhǔn)確，分析時(shí)間短，回收率高，但示差折光檢測器對溫度比較敏感，影響試驗(yàn)結(jié)果；張建杰等[34]采用液相色譜示差折光檢測法檢測了水產(chǎn)品中的幾種糖，核糖、葡萄糖、果糖等分離效果良好，這幾個(gè)單糖的回收率在70.2%～98.5%，此方法不需要衍生，簡單，分離效果好，但是加標(biāo)回收率較低，出現(xiàn)倒峰。

表1 柱前衍生與柱后衍生比較Table 1 Comparison of pre-column derivatization and post-column derivatization

表2 3種衍生劑的特點(diǎn)比較Table 2 Comparison of the characteristics of 3 derivatives

2.2 液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法

蒸發(fā)光散射檢測器是通用型檢測器之一，是示差折光檢測器的升級。蒸發(fā)光散射檢測器的原理為：檢測器中高速氮?dú)鈱⒋郎y物噴成霧狀液滴，流動(dòng)相揮發(fā)后形成微小顆粒，載氣把這些顆粒帶到檢測器的散射室，從而檢測出散射光的強(qiáng)度[35]。液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法不僅彌補(bǔ)了示差折光檢測法不能梯度洗脫等不足之處，也彌補(bǔ)了紫外檢測不能檢測無紫外吸收或只有紫外末端吸收物質(zhì)的缺陷[36]。該方法可以進(jìn)行梯度洗脫，同時(shí)也消除了流動(dòng)相及溫度變化帶來的基線漂移問題，而且具有較高的靈敏度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性；但不能使用非揮發(fā)性緩沖鹽作為流動(dòng)相且較高的檢測成本也制約其應(yīng)用范圍[37-38]。

Ding H等[39]用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法同時(shí)檢測了食品中的13種糖，測得這13種糖的檢出限為0.1～5.0 g/mL，加標(biāo)回收率為96.1%～105.2%，相對偏差較低，此方法高效、簡單、準(zhǔn)確，為HPLC-ELSD提供了良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)和方法；沈少林等[40]檢測了10種蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的含量，對色譜條件和檢測器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)2種單糖的檢出限為10 mg/L，是示差折光檢測法高10倍以上，彌補(bǔ)了示差折光檢測法的缺點(diǎn)；尚姝等[41]建立了HPLC-ELSD法檢測保健食品中的幾種單糖和雙糖的方法，檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)這幾種糖的分離度都大于2.0，比較適合檢測多種單糖，但是對溫度比較敏感，需要嚴(yán)格控制；劉倩等[42]用HPLC-ELSD法分離和定量檢測了啤酒中的糖類化合物，兩種單糖濃度為0.05～5.00 g/L，它驗(yàn)證該方法的回收率為94～98.4%，果糖和葡萄糖的RSD分別為2.78～2.89%，3.02～3.11%，此方法不需要衍生處理，簡單、準(zhǔn)確，適合測定啤酒中的單糖，但檢測過程中出現(xiàn)了雜峰。

蒸發(fā)光散射檢測器(HLSD)相對于示差折光檢測器(RID)靈敏度高，不受其他因素的影響，這2種檢測器的優(yōu)缺點(diǎn)比較見表3。

表3 ELSD與RID的比較Table 3 Comparison of ELSD and RID

2.3 質(zhì)譜法

近年來，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)已經(jīng)成為一種適用于大量分析微量有機(jī)混合物的創(chuàng)新分析技術(shù)。與氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)的“傳統(tǒng)”技術(shù)相比，LC-MS/MS更易于使用，適用于相當(dāng)多的相關(guān)分析物。液相色譜-質(zhì)譜法在檢測單糖過程中也廣泛使用。天然糖由于具有高親水性不能保留在烷基鍵合硅膠柱如C18上，因此它們的分離不可能使用反相液相色譜。在另一方面，已經(jīng)提出了各種色譜方法來分離糖類和寡糖，包括配體交換層析[43]、尺寸排阻層析[44]，以及在二氧化硅基粘合極性固定相上廣泛使用的親水色譜法[45]。未衍生碳水化合物的分離需要特定類型的色譜柱，如烷基化硅膠[46]或各種離子交換媒體[47]，其中特定的抗衡離子的添加影響分離。但是，大多數(shù)都有問題，尤其是在柱穩(wěn)定性，壽命和分離重現(xiàn)性方面。因此，在此工作中使用UPLC酰胺BEH柱分離單糖和寡糖而無需預(yù)先衍生化。Ayman A等[48]用此方法檢測了單糖和二糖，使用乙腈-水在BEH酰胺柱上進(jìn)行梯度洗脫，使用選擇離子記錄(SIR)采集模式進(jìn)行采集檢測，檢出限分別為0.25，0.69，0.82，3.58 lg mL-1，有良好的線性關(guān)系。該方法比較快速，對pH不敏感，有良好的效率和重現(xiàn)性，能分離各種各樣的高度極性化合物，但儀器成本高，對試劑的要求也很高。

3 展望

近年來，高效液相色譜法在單糖的分析中使用比較廣泛，結(jié)合國內(nèi)外現(xiàn)狀看，單糖的分析情況與未來研究方向是：

(1) 直接檢測法中液相色譜示差折光檢測法是通用性的檢測器，但是靈敏度較低、不能梯度洗脫；液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法無需衍生，靈敏度較高。這2種方法分離度較差，提高分離度是以后研究的方向。

(2) 柱前衍生中，對氨基苯甲酸和鄰氨基苯甲酸是有毒的衍生劑，其中PMP柱前衍生化使用范圍最廣泛且無毒，但是柱前衍生過程中衍生劑的添加，會(huì)引入一些雜質(zhì)，對試驗(yàn)結(jié)果會(huì)造成誤差，怎樣減少誤差是要解決的問題之一。

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