黃依佳

吳劍榮

朱 莉

詹曉北

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

由于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)排放和環(huán)境氣候的影響，水體的富營養(yǎng)化促使諸多湖泊中藍(lán)藻快速生長，形成嚴(yán)重的藍(lán)藻水華現(xiàn)象[1]。藍(lán)藻又稱藍(lán)細(xì)菌，是最古老的藻類之一，具有結(jié)構(gòu)簡單、分布廣泛、生長迅速等特點(diǎn)，是世界上各國湖泊中生長持續(xù)時(shí)間長和規(guī)模大的水華藻類之一[2]。藍(lán)藻水華類主要含有微囊藻屬(Microcystis)和魚腥藻屬(Anabaena)，共計(jì)2屬13種，其中微囊藻屬是太湖水華的主要優(yōu)勢種類[3]。藍(lán)藻的大規(guī)模生長將導(dǎo)致水體溶氧量降低等生態(tài)系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致其他藻類和魚類等產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，也對水源水質(zhì)形成破壞，造成飲用水危機(jī)[2]。目前，治理湖泊水系藍(lán)藻水華的主要措施仍以打撈為主，主要應(yīng)用包括堆肥和沼氣發(fā)酵，但還未形成高附加值開發(fā)利用。

為有效處理打撈藍(lán)藻以避免出現(xiàn)二次污染，并開發(fā)相應(yīng)的加工工藝同時(shí)獲得較高附加值產(chǎn)品。已有學(xué)者對藍(lán)藻進(jìn)行應(yīng)用開發(fā)研究，如利用藍(lán)藻厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣[4]、用于酵母蛋白生產(chǎn)、水解制備混合氨基酸、提取藻膽蛋白和天然色素[5]等。藍(lán)藻細(xì)胞壁、莢膜和黏質(zhì)組成的外層都含有豐富的多糖[4]，其中蛋白質(zhì)和多糖總量超過干重的70%以上。目前也有將干燥藍(lán)藻粉用做生物塑料原料的專利，但是其中的多糖組分會(huì)影響塑料品質(zhì)，塑料殘留有部分臭味。天然多糖具有良好的生物活性和功能，包括抗腫瘤[6]、抗病毒[7]、免疫作用[6]和抗氧化作用[8]等。在對其他藻類如紫球藻[9]、馬尾藻[10]、螺旋藻[11]的研究中，通過多種提取方法都得到了具有良好生物活性的藻類多糖。

目前已有包括太湖藍(lán)藻和巢湖藍(lán)藻的多糖提取研究。在藍(lán)藻的多糖提取研究中，熱水浸提由于提取過程簡單、成本較低仍然是主要的提取方法，但單純使用熱水浸提方法存在提取得率低、原料利用率不足等缺點(diǎn)[12]。同時(shí)，對提取得到的藍(lán)藻多糖結(jié)構(gòu)，目前較多研究采用較為常用的方法進(jìn)行分析[13]，但仍需進(jìn)一步對其單糖的糖苷鍵連接方式進(jìn)行描述，以了解藍(lán)藻多糖區(qū)別于其他具有生物活性多糖的結(jié)構(gòu)特征?；谏鲜隹紤]，本研究主要以提高藍(lán)藻多糖的提取得率和分析藍(lán)藻多糖的結(jié)構(gòu)特征為目標(biāo)，進(jìn)一步分析藍(lán)藻多糖的抗氧化活性以明晰其潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

填料DEAE Fast Flow、Sephadex G-100：美國GE公司；

藍(lán)藻粉：無錫德林海公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、1,10-菲咯啉：純度>99%，美國Sigma公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：1100型，美國安捷倫科技有限公司；

氣相色譜儀：GC-2010AF型，日本島津公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：NEXUS型，美國尼高力儀器公司；

核磁共振儀：Avance III型，德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)藻多糖的分離純化 采用超聲波輔助熱水浸提的方法[(經(jīng)試驗(yàn)得出其最佳提取工藝為：超聲400 W處理30 min，料液比1∶40 (g/mL)，浸提溫度80 ℃，浸提時(shí)間5 h]得到藍(lán)藻粗多糖；用Savage法去蛋白，其中氯仿∶正丁醇(體積比)=4∶1，Savage試劑∶樣液(體積比)=1∶1，處理時(shí)間為30 min，處理6次；5倍體積95%乙醇醇沉；凍干復(fù)溶，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后經(jīng)DEAE Fast Flow離子交換柱純化，用水和不同濃度NaCl溶液洗脫，收集洗脫液并利用苯酚硫酸法檢測多糖含量，收集的多糖于25 ℃下經(jīng)透析后冷凍干燥，復(fù)溶為多糖溶液后由Sephadex G-100凝膠柱純化，收集并檢測多糖含量后，收集多糖主要組分CB-2-1，凍干用于后續(xù)結(jié)構(gòu)分析和自由基清能力檢測。

1.3.2 藍(lán)藻多糖的單糖組成和相對分子質(zhì)量測定 稱取20 mg 凍干的純化多糖樣品，用2 mL 1 mol/L硫酸在沸水中水解2 h，用碳酸鋇將pH調(diào)至6.5～7.0，離心(8 000 r/min,10 min)2次去除其中的不溶物，上清液加入1 mL的1 mg/mL 肌醇溶液作為內(nèi)標(biāo)，冷凍干燥的水解單糖加入0.5 mL 吡啶和10 mg鹽酸羥胺，90 ℃加熱30 min，加入0.5 mL 乙酸酐后90 ℃加熱30 min，采用GC-MS分析[14]，條件：AgiLentDB-5ms毛細(xì)柱管(30 m×0.25 mm×0.25 μL)，載氣He，流量1 mL/min，柱溫60～250 ℃，程序升溫5 ℃/min，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣器溫度250 ℃。氣-質(zhì)譜連接通道溫度為250 ℃。EI離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV。

純化的藍(lán)藻多糖溶于去離子水中(10 mg/mL)，于8 000 r/min 離心5 min后，利用高效液相色譜檢測多糖的相對分子質(zhì)量，以相對分子質(zhì)量為2.700，5.200，9.750，1.305，3.680 kDa 的葡聚糖作為標(biāo)品進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 紅外光譜分析 取凍干的純化多糖樣品和粗多糖樣品1～2 mg，分別加入適量溴化鉀進(jìn)行研磨，壓片后，利用紅外光譜在400～4 000 cm-1內(nèi)進(jìn)行檢測[15]。

1.3.4 核磁共振(NMR)分析 取藍(lán)藻多糖干燥樣品CB-2-1組分50 mg，溶于5 mL D2O(99.8%)中，充分溶解，采用NMR分析獲得1H譜和13C譜。

1.3.5 藍(lán)藻多糖的抗氧化活性

(1) DPPH自由基清除率和還原力的測定：參照文獻(xiàn)[16]。

(2) 羥自由基清除測定：參照文獻(xiàn)[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)藻多糖的分離純化

藍(lán)藻粗多糖首先經(jīng)過離子交換層析(DEAE Fast Flow)進(jìn)行分離純化，結(jié)果見圖1。藍(lán)藻粗多糖經(jīng)水和不同濃度NaCl溶液洗脫后得到3個(gè)多糖組分，其中由0.1 mol/L NaCl溶液洗脫得到的CB-2組分為主要組分。因此收集CB-2組分，透析，再利用Sephadex G-100凝膠柱進(jìn)一步純化。如圖1(b) 所示，經(jīng)凝膠柱分離后得到的CB-2-1組分較為均一，因此收集并凍干后用于后續(xù)結(jié)構(gòu)和自由基清除能力的分析。

圖1 藍(lán)藻粗多糖的層析分離純化Figure 1 Chromatographic purification of Cyanobacteria polysaccharide

2.2 藍(lán)藻多糖的單糖組分和相對分子質(zhì)量

比較藍(lán)藻粗多糖和純化多糖組分CB-2-1的單糖組成時(shí)發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，見表1。純化后，藍(lán)藻多糖CB-2-1中的鼠李糖、葡萄糖的摩爾百分比明顯下降，而其他單糖相比粗多糖有明顯提高，其中甘露糖摩爾百分比由14.40%提高至51.38%，成為藍(lán)藻多糖CB-2-1中的主要單糖。藍(lán)藻多糖CB-2-1相對分子質(zhì)量為8.4 kDa，與馬尾藻多糖組分SPP-3-1和SPP-3-2相對分子質(zhì)量相近[17]。不同藻類多糖中單糖組成具有較大差異，如石全見等[9]研究紫球藻多糖時(shí)發(fā)現(xiàn)，木糖、葡萄糖和半乳糖3種單糖最多；而在小球藻多糖[18]的單糖組成中，葡萄糖和半乳糖組分居多。由于藍(lán)藻多糖是來源于混合微生物，因此其多糖組成也會(huì)變化較大。

表1 藍(lán)藻粗多糖與純化多糖CB-2-1的單糖組成和相對分子質(zhì)量Table 1 Molecular weight and monosaccharide composition of Cyanobacteria polysaccharide and polysaccharide CB-2-1

2.3 藍(lán)藻多糖CB-2-1的紅外光譜分析

藍(lán)藻多糖CB-2-1的FTIR光譜分析見圖2。吸收峰在3 600～3 000，2 000～2 800，1 400～1 200，1 200～700 cm-1是特征吸收峰。多糖在3 384 cm-1的吸收峰是羥基的拉伸，在2 919 cm-1的吸收峰屬于羰基振動(dòng)，1 388 cm-1的吸收峰代表羧酸和羧基的對稱伸縮振動(dòng)，1 315，1 242 cm-1的吸收峰分別代表羧酸和C—O拉伸，在1 140 cm-1的吸收峰屬于糖苷鍵(C—O—C)拉伸振動(dòng)，吸收峰在922，759 cm-1屬于D-吡喃葡萄糖環(huán)的不對稱環(huán)振動(dòng)。通過紅外光譜分析結(jié)果可知，藍(lán)藻多糖CB-2-1具有典型的多糖紅外吸收峰[19]。

圖2 藍(lán)藻多糖CB-2-1的紅外光譜圖Figure 2 Infrared spectra of Cyanobacteria polysaccharide CB-2-1

2.4 藍(lán)藻多糖CB-2-1的核磁共振分析

采用核磁共振對藍(lán)藻多糖CB-2-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見圖3。在1H譜中，異頭氫的化學(xué)位移出現(xiàn)5.35，5.31，5.17，同時(shí)還在4.99，4.59出現(xiàn)化學(xué)位移，表明CB-2-1同時(shí)含有α-和β-型糖苷鍵，并且α-型糖苷鍵的比例要高于β-型糖苷鍵[20]。在13C譜中，異頭碳的化學(xué)位移大都小于101，大于101的異頭碳信號(hào)比較微弱，與1H譜圖結(jié)果具有相似性，即多糖CB-2-1的連接方式以α-型糖苷鍵為主，同時(shí)含有少量的β-型糖苷鍵[21]。此外，13C譜圖在化學(xué)位移78～85時(shí)沒有出現(xiàn)較強(qiáng)的響應(yīng)信號(hào)，可能是由于在C-2、C-3、C-4位上并未發(fā)生取代。由于在化學(xué)位移177附近并沒有檢測到明顯的信號(hào)，因此CB-2-1中不含有糖醛酸，這一結(jié)果與上述CB-2-1單糖組成的結(jié)果一致。

圖3 藍(lán)藻多糖CB-2-1的1H NMR譜圖和13C NMR譜圖Figure 3 1H NMR and 13C NMR spectra of Cyanobacteria polysaccharide CB-2-1

2.5 藍(lán)藻多糖CB-2-1的抗氧化活性

在之前的報(bào)道[22]中，天然多糖都具有良好的抗氧化活性，包括體外多種自由基清除能力和還原力。在不同細(xì)胞模型試驗(yàn)中，胞內(nèi)有氧代謝過程中會(huì)產(chǎn)生多種活性氧簇(ROS)，包括超氧自由基、羥基自由基等[23-24]，ROS的存在會(huì)造成胞內(nèi)DNA損傷和影響胞內(nèi)正常代謝等負(fù)面作用。多糖所具有的抗氧化活性尤其是自由基清除能力，可有效減少自由基對細(xì)胞造成的損傷。

2.5.1 DPPH自由基清除活性 為了進(jìn)一步測試提取的藍(lán)藻多糖在食品和飼料添加劑中應(yīng)用的可行性，對其自由基清除能力進(jìn)行測定。如圖4所示，隨著多糖濃度的增加，藍(lán)藻粗多糖(CCB)對DPPH自由基的清除率逐漸增強(qiáng)；相比藍(lán)藻粗多糖，純化后的藍(lán)藻多糖CB-2-1對DPPH自由基的清除率明顯提高。當(dāng)CB-2-1的濃度達(dá)到2 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到最高(98.75%)，與陽性對照VC的基本相同，而藍(lán)藻粗多糖在相同濃度下清除率為65.30%。其他藻類來源的多糖也具有較好的自由基清除能力，如紫球藻提取的多糖也具有較好的DPPH自由基清除能力，在濃度為0.5 mg/mL 時(shí)清除率趨于穩(wěn)定達(dá)到84%[9]。相比紫球藻多糖，藍(lán)藻多糖CB-2-1具有更好的DPPH自由基清除能力。

圖4 藍(lán)藻多糖的DPPH自由基清除率測定Figure 4 DPPH scavenging activities of Cyanobacteria polysaccharide

2.5.2 還原力測定 在考察藍(lán)藻多糖CB-2-1還原力的研究中發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻粗多糖(CCB)和藍(lán)藻純化多糖組分CB-2-1總還原力隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)CB-2-1的濃度為2 mg/mL 時(shí)，其在700 nm 處的吸光值為0.616，而藍(lán)藻粗多糖在相同濃度下吸光值為0.485，VC的吸光值達(dá)到1.629(見圖5)，藍(lán)藻多糖經(jīng)純化后明顯提高了多糖的總還原力。在相同多糖濃度下，Qiao等[25]從魚腥草中所提取的HCPS多糖組分的還原力為0.451；Ye等[17]從馬尾藻中提取的多糖SPP-1組分和SPP-3還原力為0.785和0.412；米酒多糖[16]和番茄多糖[19]的還原力分別為0.494，0.49。與其他來源多糖相比，藍(lán)藻多糖具有較好的還原力。

圖5 藍(lán)藻多糖的還原力測定Figure 5 Reducing power capacity of Cyanobacteria polysaccharide

2.5.3 羥基自由基清除率 羥基自由基是活性氧的一種，對細(xì)胞內(nèi)的DNA、細(xì)胞器和細(xì)胞膜具有損傷作用，多種植物多糖都具有良好的羥基自由基清除能力。由圖6可知，隨著濃度的增加，藍(lán)藻粗多糖(CCB)和藍(lán)藻純化多糖組分CB-2-1對羥基自由基清除率增強(qiáng)，多糖純化后對羥基自由基的清除率明顯提高。當(dāng)CB-2-1的濃度為1.6 mg/mL時(shí)，羥基自由基的清除率為72.64%，而藍(lán)藻粗多糖在相同條件下清除率為48.45%，VC的自由基清除率則達(dá)到98.0%。其他藻類多糖也具有較好的羥基自由基清除能力，如Chen等[26]從薔薇藻中提取的多糖CEP和DEPS組分在1.6 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率分別為40.13%，37.62%。當(dāng)CB-2-1的濃度為2 mg/mL 時(shí)，羥基自由基的清除率為77.9%，而CCB在相同濃度下清除率為60.6%；Qiao等[25]從魚腥草中所提取的HCPS-3組分和HCPS在濃度為2 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率為89.51%，62.99%；此外，裙帶菜孢子葉多糖和巴夫藻多糖[27-28]亦有較高的羥基自由基清除能力。太湖藍(lán)藻多糖具有較高的羥基自由基清除率，在未來可應(yīng)用于相關(guān)動(dòng)物營養(yǎng)領(lǐng)域。

圖6 藍(lán)藻多糖的羥基自由基清除率Figure 6 Hydroxyl radicals scavenging activities capacity of Cyanobacteria polysaccharide

3 結(jié)論

本試驗(yàn)針對藍(lán)藻多糖建立了超聲輔助熱水浸提、層析分離純化得到藍(lán)藻多糖主要組分CB-2-1，在分析該多糖主要單糖和摩爾百分比的基礎(chǔ)上，了解單糖間主要連接方式以α-型糖苷鍵為主。藍(lán)藻多糖組分CB-2-1具有較高的自由基清除能力和還原力，可以作為抗氧化劑應(yīng)用于動(dòng)物營養(yǎng)、飼料等領(lǐng)域，顯示了藍(lán)藻多糖具有良好的潛在應(yīng)用價(jià)值。在后續(xù)工作中，可采用1H-1H、1H-13C和13C-13C等二維核磁質(zhì)譜方法進(jìn)一步表征太湖藍(lán)藻多糖的結(jié)構(gòu)特征，探索太湖藍(lán)藻多糖區(qū)別于其他多糖的結(jié)構(gòu)。此外，針對藍(lán)藻多糖具有的良好抗氧化活性和自由基清除能力，可進(jìn)一步考慮開展基于藍(lán)藻多糖的天然防腐劑的相關(guān)研究，并在細(xì)胞或動(dòng)物模型上考察藍(lán)藻多糖的安全性和生物活性，為最終實(shí)現(xiàn)藍(lán)藻多糖的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

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