張 俊

李 進(jìn)1,2,3

呂海英1,2,3

馬 雪1,2,3

(1.新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆師范大學(xué)干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054；3.新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054)

扁桃(AmygdaluscommunisL.)，薔薇科(Rosaceae)桃屬(AmygdalusL.)喬木，是世界上著名的干果樹種[1]。扁桃果仁富含不飽和脂肪酸、人體必需氨基酸、多種維生素、鈣、鎂、鈉、鐵、硒、鋇、鉻等元素[2]。中國扁桃的規(guī)模化生產(chǎn)主要集中在新疆的喀什與和田地區(qū)[3]，作為新疆地區(qū)的特色果品。在其加工過程中果皮一般作為廢棄物丟棄，或作為牛羊飼料，使資源嚴(yán)重浪費(fèi)，給環(huán)境造成一定污染。

研究[4]表明，扁桃果皮乙醇提取物中含有熊果酸。熊果酸廣泛存在于山茱萸、山楂、枇杷葉、女貞子、苦丁茶等多種天然植物中[5]，具有抗氧化[6]、保肝[7]、抗炎[8]、抑菌[9]、降血脂[10]、抗腫瘤[11]等多種生物學(xué)功能，因而被廣泛地用于醫(yī)藥及保健食品等領(lǐng)域[12]。目前，對(duì)扁桃果皮熊果酸的相關(guān)研究較少，已有研究中，李維霞等[4]對(duì)扁桃果皮熊果酸進(jìn)行超聲波提取，采用高效液相色譜測(cè)定了熊果酸的含量，但關(guān)于扁桃果皮熊果酸乙醇浸提工藝及其抗氧化活性研究還未見報(bào)道。本研究擬以扁桃果皮為原料提取熊果酸，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并對(duì)扁桃果皮熊果酸體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為提高扁桃果皮的開發(fā)利用、增加其附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

扁桃果皮：采自新疆莎車縣扁桃種植區(qū)；

1,1-苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)：純度≥99%，美國Sigma公司；

抗壞血酸：純度≥98%，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RV10型，德國IKA集團(tuán)；

真空干燥箱：ZK-82A型，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；

循環(huán)水式真空泵：SHB-III型，上海申勝生物技術(shù)有限公司；

臺(tái)式離心機(jī)：TDL-60-B型，長沙湘儀儀器離心機(jī)有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-2800型，上海龍尼柯儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取工藝流程

扁桃果皮→干燥粉碎→過篩(40目)→乙醇浸提→抽慮→濃縮(蒸干乙醇)→加入蒸餾水→靜置→離心沉淀(3 000 r/min，10 min)→干燥(50 ℃)→粗熊果酸

1.3.2 扁桃果皮熊果酸含量測(cè)定 參考李瑩等[13]的方法，準(zhǔn)確吸取0.1 mL扁桃果皮熊果酸提取液測(cè)定熊果酸含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.067x-0.003 3(R2=0.997 8)，按式(1) 計(jì)算扁桃果皮提取液中熊果酸得率。

(1)

式中：

Y——熊果酸得率，%；

C——標(biāo)熊果酸質(zhì)量濃度，mg/mL；

V0——移取液定容體積，mL；

V1——提取液定容后的體積，mL；

V2——移取液體積，mL；

m——扁桃果皮干粉的質(zhì)量，g。

1.3.3 扁桃果皮熊果酸提取單因素試驗(yàn)

(1) 乙醇濃度：準(zhǔn)確稱取2.0 g扁桃果皮，按料液比1∶20 (g/mL)，提取溫度75 ℃，提取時(shí)間1.5 h，乙醇濃度分別為65%，70%，75%，80%，85%，考察不同乙醇濃度對(duì)扁桃果皮熊果酸得率的影響。

(2) 料液比：準(zhǔn)確稱取2.0 g扁桃果皮，乙醇濃度75%，提取溫度75 ℃，提取時(shí)間1.5 h，液料比分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)，考察料液比對(duì)扁桃果皮熊果酸得率的影響。

(3) 提取溫度：準(zhǔn)確稱取2.0 g扁桃果皮，乙醇濃度75%，按料液比1∶20 (g/mL)，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度分別為65，70，75，80，85 ℃，考察提取溫度對(duì)扁桃果皮熊果酸得率的影響。

(4) 提取時(shí)間：準(zhǔn)確稱取2.0 g扁桃果皮，乙醇濃度75%，液料比1∶20 (g/mL)，提取溫度75 ℃，提取時(shí)間分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，考察提取時(shí)間對(duì)扁桃果皮熊果酸得率的影響。

1.3.4 扁桃果皮熊果酸提取正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，分別考察乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)扁桃果皮熊果酸得率的影響。

1.3.5 扁桃果皮熊果酸體外抗氧化活性測(cè)定

(1) 還原能力測(cè)定：參考文獻(xiàn)[14]，再以相同濃度的VC溶液作陽性對(duì)照，還原能力計(jì)算按式(2)：

H=A1-A2，

(2)

式中：

H——還原能力；

A1——樣品吸光度；

A2——空白組吸光度。

(2) 清除DPPH·能力：參考文獻(xiàn)[15～16]，用無水乙醇配制0.2 nmol/L的DPPH溶液。準(zhǔn)確吸取2 mL不同濃度的樣品溶液，分別加入2 mL DPPH溶液，混勻，室溫避光靜置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度?？瞻捉M以DPPH溶液代替樣品溶液，對(duì)照組用無水乙醇代替DPPH溶液，平行測(cè)定3次，取平均值。以相同濃度的VC溶液作陽性對(duì)照，按式(3) 計(jì)算DPPH·的清除率。

(3)

式中：

R——自由基清除率，%；

A1——樣品吸光度；

A2——對(duì)照組吸光度；

A0——空白組吸光度。

(3) 清除·OH能力：參考文獻(xiàn)[17～18]的方法并略作修改，取1 mL不同濃度的樣品溶液，依次加入1 mL 9 mmol/L 硫酸亞鐵，1 mL 9 mmol/L水楊酸， 1 mL 8.8 mmol/L 雙氧水，37 ℃水浴 15 min 后取出，于510 nm處測(cè)吸光度。對(duì)照組以蒸餾水代替水楊酸，空白組以蒸餾水代替熊果酸溶液，平行測(cè)定3次，取平均值。以相同濃度的VC溶液作陽性對(duì)照，按式(3)計(jì)算·OH清除率。

(4) 抑制小鼠紅細(xì)胞氧化溶血的影響：參考文獻(xiàn)[19]，小鼠眼球取血盛于有抗凝劑的離心管中，以3 000 r/min離心20 min，用冰冷生理鹽水洗滌3次， 再以生理鹽水配制成體積分?jǐn)?shù)為0.5%的紅細(xì)胞懸浮液，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?00 μL 不同質(zhì)量濃度樣品溶液，分別加入1.0 mL的紅細(xì)胞懸浮液，混勻，加入0.1 mL 100 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃ 水浴1 h后取出，加入4.8 mL 生理鹽水，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，于415 nm處測(cè)吸光度?？瞻捉M以生理鹽水代替樣品溶液。以相同濃度的VC溶液作陽性對(duì)照，抑制率按式(4)計(jì)算：

(4)

式中：

E——抑制率，%；

A1——對(duì)照吸光度；

A2——樣品吸光度。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2010、SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有試驗(yàn)平行測(cè)定3次，采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 扁桃果皮熊果酸提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)扁桃果皮熊果酸得率的影響 由圖1可知，乙醇濃度在60%～70%時(shí)，扁桃果皮熊果酸得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，扁桃果皮熊果酸得率達(dá)到最大值，之后隨著乙醇濃度的增加扁桃果皮熊果酸得率逐漸下降。其原因根據(jù)相似相溶原理解釋[20]，乙醇濃度為70%時(shí)極性與扁桃果皮熊果酸的極性相接近，得率最高，故選擇乙醇濃度為70%。

圖1 乙醇濃度對(duì)扁桃果皮熊果酸得率的影響Figure 1 Effects of ethanol concentration on the yield of ursolic acid from Amygdalus communis L.peel

2.1.2 料液比對(duì)扁桃果皮熊果酸得率的影響 如圖2所示，隨溶劑用量的增加，扁桃果皮熊果酸得率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20 (g/mL)時(shí)，得率達(dá)到最大值，之后隨著溶劑用量的增加，扁桃果皮熊果酸得率逐漸下降?？赡苁侨軇┯昧窟^多，濃縮時(shí)間較長，熊果酸損失增加[21]。故選擇料液比為1∶20 (g/mL)。

2.1.3 提取溫度對(duì)扁桃果皮熊果酸得率的影響 由圖3可知，在65～80 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，扁桃果皮熊果酸得率逐漸上升，繼續(xù)升高溫度，扁桃果皮熊果酸得率趨于平穩(wěn)。因?yàn)闇囟冗^高，提取液黏度變大，這種高黏液體對(duì)固液分離較不利[22]，另一方面，溫度過高可能會(huì)破壞熊果酸結(jié)構(gòu)[23]。

圖2 料液比對(duì)扁桃果皮熊果酸得率的影響Figure 2 Effects of solid-liquid ratio on the yield of ursolic acid from Amygdalus communis L.peel

圖3 提取溫度對(duì)扁桃果皮熊果酸提率的影響Figure 3 Effects of extraction temperature on the yield of ursolic acid from Amygdalus communis L.peel

故選擇溫度為80 ℃。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)扁桃果皮熊果酸得率的影響 如圖4所示，在1.5 h內(nèi)，扁桃果皮熊果酸得率隨提取時(shí)間的延長而升高；1.5 h以后，隨時(shí)間的延長得率逐漸下降。說明在1.5 h后，熊果酸基本溶出，延長時(shí)間產(chǎn)生的熱量會(huì)破壞熊果酸的結(jié)構(gòu)，使扁桃果皮熊果酸得率下降。故選擇提取時(shí)間為1.5 h。

2.2 扁桃果皮熊果酸提取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，正交試驗(yàn)因素與水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。由表2可知，最優(yōu)提取條件為A1B2C2D2，即乙醇濃度65%、浸提溫度80 ℃、料液比1∶20 (g/mL)、浸提時(shí)間1.5 h。在此條件下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得扁桃果皮熊果酸得率為2.89%。由表3可知，乙醇濃度，料液比對(duì)扁桃果皮熊果酸得率有顯著影響。各提取因素對(duì)扁桃果皮熊果酸提取得率影響的主次順序?yàn)椋阂掖紳舛?料液比>提取時(shí)間>提取溫度。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal array design

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal array design

表3 正交試驗(yàn)方差分析?Table 3 Variance analysis of orthogonal test

? *表示差異顯著，P<0.05。

2.3 扁桃果皮熊果酸抗氧化活性

2.3.1 扁桃果皮熊果酸還原能力測(cè)定 物質(zhì)的還原能力是評(píng)價(jià)其抗氧化活性的重要指標(biāo)。由圖5可以看出，扁桃果皮熊果酸和VC都有還原能力。0.06 mg/mL的扁桃果皮熊果酸的還原能力同0.02 mg/mL的VC相當(dāng)，但在濃度為0.10 mg/mL 時(shí)VC吸光度為0.80，而扁桃果皮熊果酸吸光度為0.26。

2.3.2 扁桃果皮熊果酸對(duì)DPPH·清除能力 DPPH·乙醇溶液呈紫色，在517 nm波長處有特征吸收[24]。如圖6所示，扁桃果皮熊果酸和VC都有清除DPPH·的作用。在0.01～0.03 mg/mL時(shí)，隨著扁桃果皮熊果酸質(zhì)量濃度的增加，DPPH·清除率逐漸增大，在0.04～0.10 mg/mL時(shí)，扁桃果皮熊果酸對(duì)DPPH·清除效果與VC相接近。

圖5 扁桃果皮熊果酸的還原能力Figure 5 Reducing powers of ursolic acid from Amygdalus communis L.peel

圖6 扁桃果皮熊果酸對(duì)DPPH·的清除能力Figure 6 Scavenging effects of ursolic acid from Amygdalus communis L.peel on DPPH

2.3.3 扁桃果皮熊果酸對(duì)·OH清除能力 ·OH清除率是抗氧化能力的重要指標(biāo)，采用Fenton反應(yīng)檢測(cè)扁桃果皮熊果酸清除·OH能力，H2O2與Fe2+反應(yīng)生成活性很高的·OH，·OH與水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm波長處有特征吸收[25-26]。由圖7可知，扁桃果皮熊果酸和VC都有清除·OH的作用。在0.01～0.10 mg/mL時(shí)，隨著扁桃果皮熊果酸和VC濃度的增加，·OH清除率逐漸增大最后趨于恒定，當(dāng)扁桃果皮熊果酸的濃度為0.10 mg/mL時(shí)，清除率最大為62.11%。

圖7 扁桃果皮熊果酸對(duì)·OH的清除能力Figure 7 Scavenging effects of ursolic acid from Amygdalus communis L.peel on hydroxyl

2.3.4 扁桃果皮熊果酸對(duì)紅細(xì)胞氧化溶血抑制能力 由圖8 可知，扁桃果皮熊果酸和VC都有抑制紅細(xì)胞氧化溶血的作用。在0.1～0.6 mg/mL時(shí)，紅細(xì)胞氧化溶血抑制率隨著扁桃果皮熊果酸和VC濃度的增加而增大，當(dāng)扁桃果皮熊果酸的濃度為0.6 mg/mL時(shí)，抑制率最大為97.83%，紅細(xì)胞氧化溶血抑制率明顯高于VC。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了扁桃中熊果酸的提取工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明：最優(yōu)提取工藝條件：乙醇濃度65%、浸提溫度80 ℃、料液比1∶20 (g/mL)、浸提時(shí)間1.5 h。在此條件下測(cè)得扁桃果皮熊果酸提取得率為2.89%。

圖8 扁桃果皮熊果斷抑制紅細(xì)胞氧化溶血的能力Figure 8 Inhibitions effect of ursolic acid on from Amygdalus communis L.peel hemolysis of erythrocytes

體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，扁桃果皮熊果酸表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，0.06 mg/mL的扁桃果皮熊果酸的還原能力同0.02 mg/mL的VC相當(dāng)；在0.04～0.10 mg/mL時(shí)，扁桃果皮熊果酸與VC對(duì)DPPH自由基清除效果接近；當(dāng)扁桃果皮熊果酸的濃度為0.1 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH清除率為62.11%，低于同濃度VC的；當(dāng)扁桃果皮熊果酸的濃度為0.6 mg/mL時(shí)，對(duì)紅細(xì)胞氧化溶血抑制率高達(dá)97.83%，明顯高于同濃度VC的。

本研究僅對(duì)扁桃果皮熊果酸的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，后續(xù)試驗(yàn)中可對(duì)扁桃果皮熊果酸的組織抗氧化和體內(nèi)小鼠抗氧化作進(jìn)一步研究。

[1] 孫月娥, 明鳴, 王衛(wèi)東, 等.巴旦木蛋白提取工藝[J].食品科學(xué), 2011, 32(18): 19-23.

[2] 蘭彥平, 吐拉克孜, 郭文英, 等.巴旦杏的研究現(xiàn)狀及開發(fā)利用前景[J].林業(yè)科學(xué)研究, 2004, 17(5): 674-679.

[3] 尤努斯江·吐拉洪, 馬木提·庫爾班, 木妮熱·依布拉音.巴旦木的營養(yǎng)保健作用研究進(jìn)展[J].中國食物與營養(yǎng), 2008, 14(10): 56-58.

[4] 李維霞, 魏佳, 蘇玉紅, 等.高效液相色譜法測(cè)定巴旦木青皮提取物中齊墩果酸和熊果酸[J].食品科學(xué), 2016, 37(10): 151-157.

[5] 盧靜, 張博超, 姜瑋, 等.熊果酸抗氧化性能的研究[J].食品工業(yè)科技, 2009(4): 126-127.

[6] ANTONIO E, JUNIOR O D R A, ARAJO I S D, et al.Poly (lactic acid) nanoparticles loaded with ursolic acid: Characterization and in vitro, evaluation of radical scavenging activity and cytotoxicity[J].Materials Science & Engineering C, 2016, 71: 156-166.

[7] MENG Fan-yu, NING Hua, SUN Zong-xiang, et al.Ursolic acid protects hepatocytes against lipotoxicity through activating autophagy via an AMPK pathway[J].Journal of Functional Foods, 2015, 17: 172-182.

[8] JAMAL M, IMAM S S, AQIL M, et al.Transdermal potential and anti-arthritic efficacy of ursolic acid from niosomal gel systems[J].International Immunopharmacology, 2015, 29(2): 361-369.

[9] GU Wen, HAO Yun, ZHANG Guang, et al.Synthesis, in vitro antimicrobial and cytotoxic activities of new carbazole derivatives of ursolic acid[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2015, 25(3): 554-557.

[10] 林科, 張?zhí)? 張鶴云.山楂中熊果酸的提取及其對(duì)小鼠的降血脂作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2007, 19(6): 1 052-1 054.

[11] YOON Y, LIM J W, KIM J, et al.Discovery of ursolic acid prodrug (NX-201): Pharmacokinetics and in vivo antitumor effects in PANC-1 pancreatic cancer[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2016, 26(22): 5 524-5 527.

[12] 石瑞, 張寧, 李志英, 等.β-環(huán)糊精超聲輔助提取山楂中熊果酸的研究[J].食品研究與開發(fā), 2016, 37(15): 95-99.

[13] 李瑩, 陳新梅.分光光度法測(cè)定大山楂丸中熊果酸含量[J].食品與藥品, 2013, 15(3): 200-201.

[14] 梁俊, 李建科, 趙偉, 等.石榴皮多酚體外抗脂質(zhì)過氧化作用研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2012, 31(2): 159-165.

[15] 江巖, 聶文靜.新疆藥桑椹營養(yǎng)成分分析及其體外抗氧化作用[J].食品科學(xué), 2014, 35(22): 126-129.

[16] 劉玥, 劉曉蘭, 鄭喜群, 等.復(fù)合蛋白酶水解玉米谷蛋白產(chǎn)物的抗氧化活性研究[J].食品與機(jī)械, 2015, 31(1): 141-145.

[17] 李志平, 張弛, 周維清, 等.巢湖藍(lán)藻酸性多糖的理化性質(zhì)及其體外抗氧化作用[J].食品科學(xué), 2015, 36(5): 7-12.

[18] 陳慧, 盛丹丹, 王文君.黃金茶醇提取物成分及抗氧化活性的研究[J].現(xiàn)代食品科技, 2017(1): 26-32.

[19] 仇燕, 趙爽, 杜占強(qiáng), 等.菜芙蓉花體外抗氧化活性部位的研究[J].精細(xì)化工, 2016, 33(8): 890-895.

[20] 楊艷, 任亞梅, 馬婷, 等.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取獼猴桃根熊果酸工藝[J].食品科學(xué), 2014, 35(4): 44-49.

[21] 邵金華, 馬永強(qiáng), 何福林, 等.虎舌紅多糖超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性評(píng)價(jià)[J].食品與機(jī)械, 2016, 32(12): 166-169.

[22] 郭軍, 王麗麗, 吳小說, 等.西山焦棗中熊果酸超聲法提取工藝研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2016, 32(19): 175-181.

[23] 齊娜, 李涵, 張志宇, 等.新疆紅肉蘋果多酚的超聲波輔助提取工藝優(yōu)化[J].食品與機(jī)械, 2016, 32(9): 177-182.

[24] 游玉明, 周敏, 王倩倩, 等.花椒麻素的抗氧化活性[J].食品科學(xué), 2015, 36(13): 27-31.

[25] 王金華, 杜超, 梁晨, 等.貴長獼猴桃多糖提取工藝及體外抗氧化功能[J].食品科學(xué), 2016, 37(20): 19-23.

[26] 張津鳴, 鐘筱婷, 盛德喬, 等.資木瓜總黃酮的體內(nèi)外抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2016, 28(10): 1 602-1 606.