張 俊

李 進1,2,3

呂海英1,2,3

馬 雪1,2,3

(1.新疆特殊環(huán)境物種保護與調控生物學實驗室，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆師范大學干旱區(qū)植物逆境生物學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054；3.新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830054)

扁桃(AmygdaluscommunisL.)，薔薇科(Rosaceae)桃屬(AmygdalusL.)喬木，是世界上著名的干果樹種[1]。扁桃果仁富含不飽和脂肪酸、人體必需氨基酸、多種維生素、鈣、鎂、鈉、鐵、硒、鋇、鉻等元素[2]。中國扁桃的規(guī)?；a(chǎn)主要集中在新疆的喀什與和田地區(qū)[3]，作為新疆地區(qū)的特色果品。在其加工過程中果皮一般作為廢棄物丟棄，或作為牛羊飼料，使資源嚴重浪費，給環(huán)境造成一定污染。

研究[4]表明，扁桃果皮乙醇提取物中含有熊果酸。熊果酸廣泛存在于山茱萸、山楂、枇杷葉、女貞子、苦丁茶等多種天然植物中[5]，具有抗氧化[6]、保肝[7]、抗炎[8]、抑菌[9]、降血脂[10]、抗腫瘤[11]等多種生物學功能，因而被廣泛地用于醫(yī)藥及保健食品等領域[12]。目前，對扁桃果皮熊果酸的相關研究較少，已有研究中，李維霞等[4]對扁桃果皮熊果酸進行超聲波提取，采用高效液相色譜測定了熊果酸的含量，但關于扁桃果皮熊果酸乙醇浸提工藝及其抗氧化活性研究還未見報道。本研究擬以扁桃果皮為原料提取熊果酸，在單因素試驗基礎上，利用正交試驗優(yōu)化提取工藝，并對扁桃果皮熊果酸體外抗氧化活性進行評價，為提高扁桃果皮的開發(fā)利用、增加其附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

扁桃果皮：采自新疆莎車縣扁桃種植區(qū)；

1,1-苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)：純度≥99%，美國Sigma公司；

抗壞血酸：純度≥98%，上海藍季科技發(fā)展有限公司；

熊果酸標準品：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設備

旋轉蒸發(fā)儀：RV10型，德國IKA集團；

真空干燥箱：ZK-82A型，上海市實驗儀器總廠；

循環(huán)水式真空泵：SHB-III型，上海申勝生物技術有限公司；

臺式離心機：TDL-60-B型，長沙湘儀儀器離心機有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-2800型，上海龍尼柯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取工藝流程

扁桃果皮→干燥粉碎→過篩(40目)→乙醇浸提→抽慮→濃縮(蒸干乙醇)→加入蒸餾水→靜置→離心沉淀(3 000 r/min，10 min)→干燥(50 ℃)→粗熊果酸

1.3.2 扁桃果皮熊果酸含量測定 參考李瑩等[13]的方法，準確吸取0.1 mL扁桃果皮熊果酸提取液測定熊果酸含量，根據(jù)標準曲線方程y=0.067x-0.003 3(R2=0.997 8)，按式(1) 計算扁桃果皮提取液中熊果酸得率。

(1)

式中：

Y——熊果酸得率，%；

C——標熊果酸質量濃度，mg/mL；

V0——移取液定容體積，mL；

V1——提取液定容后的體積，mL；

V2——移取液體積，mL；

m——扁桃果皮干粉的質量，g。

1.3.3 扁桃果皮熊果酸提取單因素試驗

(1) 乙醇濃度：準確稱取2.0 g扁桃果皮，按料液比1∶20 (g/mL)，提取溫度75 ℃，提取時間1.5 h，乙醇濃度分別為65%，70%，75%，80%，85%，考察不同乙醇濃度對扁桃果皮熊果酸得率的影響。

(2) 料液比：準確稱取2.0 g扁桃果皮，乙醇濃度75%，提取溫度75 ℃，提取時間1.5 h，液料比分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)，考察料液比對扁桃果皮熊果酸得率的影響。

(3) 提取溫度：準確稱取2.0 g扁桃果皮，乙醇濃度75%，按料液比1∶20 (g/mL)，提取時間1.5 h，提取溫度分別為65，70，75，80，85 ℃，考察提取溫度對扁桃果皮熊果酸得率的影響。

(4) 提取時間：準確稱取2.0 g扁桃果皮，乙醇濃度75%，液料比1∶20 (g/mL)，提取溫度75 ℃，提取時間分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，考察提取時間對扁桃果皮熊果酸得率的影響。

1.3.4 扁桃果皮熊果酸提取正交試驗 在單因素試驗基礎上，設計L9(34)正交試驗優(yōu)化提取條件，分別考察乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時間對扁桃果皮熊果酸得率的影響。

1.3.5 扁桃果皮熊果酸體外抗氧化活性測定

(1) 還原能力測定：參考文獻[14]，再以相同濃度的VC溶液作陽性對照，還原能力計算按式(2)：

H=A1-A2，

(2)

式中：

H——還原能力；

A1——樣品吸光度；

A2——空白組吸光度。

(2) 清除DPPH·能力：參考文獻[15～16]，用無水乙醇配制0.2 nmol/L的DPPH溶液。準確吸取2 mL不同濃度的樣品溶液，分別加入2 mL DPPH溶液，混勻，室溫避光靜置30 min，于517 nm處測定吸光度?？瞻捉M以DPPH溶液代替樣品溶液，對照組用無水乙醇代替DPPH溶液，平行測定3次，取平均值。以相同濃度的VC溶液作陽性對照，按式(3) 計算DPPH·的清除率。

(3)

式中：

R——自由基清除率，%；

A1——樣品吸光度；

A2——對照組吸光度；

A0——空白組吸光度。

(3) 清除·OH能力：參考文獻[17～18]的方法并略作修改，取1 mL不同濃度的樣品溶液，依次加入1 mL 9 mmol/L 硫酸亞鐵，1 mL 9 mmol/L水楊酸， 1 mL 8.8 mmol/L 雙氧水，37 ℃水浴 15 min 后取出，于510 nm處測吸光度。對照組以蒸餾水代替水楊酸，空白組以蒸餾水代替熊果酸溶液，平行測定3次，取平均值。以相同濃度的VC溶液作陽性對照，按式(3)計算·OH清除率。

(4) 抑制小鼠紅細胞氧化溶血的影響：參考文獻[19]，小鼠眼球取血盛于有抗凝劑的離心管中，以3 000 r/min離心20 min，用冰冷生理鹽水洗滌3次， 再以生理鹽水配制成體積分數(shù)為0.5%的紅細胞懸浮液，4 ℃保存?zhèn)溆?。?00 μL 不同質量濃度樣品溶液，分別加入1.0 mL的紅細胞懸浮液，混勻，加入0.1 mL 100 mmol/L H2O2啟動反應，37 ℃ 水浴1 h后取出，加入4.8 mL 生理鹽水，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，于415 nm處測吸光度?？瞻捉M以生理鹽水代替樣品溶液。以相同濃度的VC溶液作陽性對照，抑制率按式(4)計算：

(4)

式中：

E——抑制率，%；

A1——對照吸光度；

A2——樣品吸光度。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2010、SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，所有試驗平行測定3次，采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 扁桃果皮熊果酸提取單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對扁桃果皮熊果酸得率的影響 由圖1可知，乙醇濃度在60%～70%時，扁桃果皮熊果酸得率呈現(xiàn)上升趨勢，當乙醇濃度為70%時，扁桃果皮熊果酸得率達到最大值，之后隨著乙醇濃度的增加扁桃果皮熊果酸得率逐漸下降。其原因根據(jù)相似相溶原理解釋[20]，乙醇濃度為70%時極性與扁桃果皮熊果酸的極性相接近，得率最高，故選擇乙醇濃度為70%。

圖1 乙醇濃度對扁桃果皮熊果酸得率的影響Figure 1 Effects of ethanol concentration on the yield of ursolic acid from Amygdalus communis L.peel

2.1.2 料液比對扁桃果皮熊果酸得率的影響 如圖2所示，隨溶劑用量的增加，扁桃果皮熊果酸得率逐漸增大，當料液比為1∶20 (g/mL)時，得率達到最大值，之后隨著溶劑用量的增加，扁桃果皮熊果酸得率逐漸下降?？赡苁侨軇┯昧窟^多，濃縮時間較長，熊果酸損失增加[21]。故選擇料液比為1∶20 (g/mL)。

2.1.3 提取溫度對扁桃果皮熊果酸得率的影響 由圖3可知，在65～80 ℃時，隨著溫度的升高，扁桃果皮熊果酸得率逐漸上升，繼續(xù)升高溫度，扁桃果皮熊果酸得率趨于平穩(wěn)。因為溫度過高，提取液黏度變大，這種高黏液體對固液分離較不利[22]，另一方面，溫度過高可能會破壞熊果酸結構[23]。

圖2 料液比對扁桃果皮熊果酸得率的影響Figure 2 Effects of solid-liquid ratio on the yield of ursolic acid from Amygdalus communis L.peel

圖3 提取溫度對扁桃果皮熊果酸提率的影響Figure 3 Effects of extraction temperature on the yield of ursolic acid from Amygdalus communis L.peel

故選擇溫度為80 ℃。

2.1.4 提取時間對扁桃果皮熊果酸得率的影響 如圖4所示，在1.5 h內，扁桃果皮熊果酸得率隨提取時間的延長而升高；1.5 h以后，隨時間的延長得率逐漸下降。說明在1.5 h后，熊果酸基本溶出，延長時間產(chǎn)生的熱量會破壞熊果酸的結構，使扁桃果皮熊果酸得率下降。故選擇提取時間為1.5 h。

2.2 扁桃果皮熊果酸提取正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，正交試驗因素與水平見表1，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。由表2可知，最優(yōu)提取條件為A1B2C2D2，即乙醇濃度65%、浸提溫度80 ℃、料液比1∶20 (g/mL)、浸提時間1.5 h。在此條件下驗證實驗測得扁桃果皮熊果酸得率為2.89%。由表3可知，乙醇濃度，料液比對扁桃果皮熊果酸得率有顯著影響。各提取因素對扁桃果皮熊果酸提取得率影響的主次順序為：乙醇濃度>料液比>提取時間>提取溫度。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal array design

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal array design

表3 正交試驗方差分析?Table 3 Variance analysis of orthogonal test

? *表示差異顯著，P<0.05。

2.3 扁桃果皮熊果酸抗氧化活性

2.3.1 扁桃果皮熊果酸還原能力測定 物質的還原能力是評價其抗氧化活性的重要指標。由圖5可以看出，扁桃果皮熊果酸和VC都有還原能力。0.06 mg/mL的扁桃果皮熊果酸的還原能力同0.02 mg/mL的VC相當，但在濃度為0.10 mg/mL 時VC吸光度為0.80，而扁桃果皮熊果酸吸光度為0.26。

2.3.2 扁桃果皮熊果酸對DPPH·清除能力 DPPH·乙醇溶液呈紫色，在517 nm波長處有特征吸收[24]。如圖6所示，扁桃果皮熊果酸和VC都有清除DPPH·的作用。在0.01～0.03 mg/mL時，隨著扁桃果皮熊果酸質量濃度的增加，DPPH·清除率逐漸增大，在0.04～0.10 mg/mL時，扁桃果皮熊果酸對DPPH·清除效果與VC相接近。

圖5 扁桃果皮熊果酸的還原能力Figure 5 Reducing powers of ursolic acid from Amygdalus communis L.peel

圖6 扁桃果皮熊果酸對DPPH·的清除能力Figure 6 Scavenging effects of ursolic acid from Amygdalus communis L.peel on DPPH

2.3.3 扁桃果皮熊果酸對·OH清除能力 ·OH清除率是抗氧化能力的重要指標，采用Fenton反應檢測扁桃果皮熊果酸清除·OH能力，H2O2與Fe2+反應生成活性很高的·OH，·OH與水楊酸產(chǎn)生有色物質，該物質在510 nm波長處有特征吸收[25-26]。由圖7可知，扁桃果皮熊果酸和VC都有清除·OH的作用。在0.01～0.10 mg/mL時，隨著扁桃果皮熊果酸和VC濃度的增加，·OH清除率逐漸增大最后趨于恒定，當扁桃果皮熊果酸的濃度為0.10 mg/mL時，清除率最大為62.11%。

圖7 扁桃果皮熊果酸對·OH的清除能力Figure 7 Scavenging effects of ursolic acid from Amygdalus communis L.peel on hydroxyl

2.3.4 扁桃果皮熊果酸對紅細胞氧化溶血抑制能力 由圖8 可知，扁桃果皮熊果酸和VC都有抑制紅細胞氧化溶血的作用。在0.1～0.6 mg/mL時，紅細胞氧化溶血抑制率隨著扁桃果皮熊果酸和VC濃度的增加而增大，當扁桃果皮熊果酸的濃度為0.6 mg/mL時，抑制率最大為97.83%，紅細胞氧化溶血抑制率明顯高于VC。

3 結論

本試驗研究了扁桃中熊果酸的提取工藝。試驗結果表明：最優(yōu)提取工藝條件：乙醇濃度65%、浸提溫度80 ℃、料液比1∶20 (g/mL)、浸提時間1.5 h。在此條件下測得扁桃果皮熊果酸提取得率為2.89%。

圖8 扁桃果皮熊果斷抑制紅細胞氧化溶血的能力Figure 8 Inhibitions effect of ursolic acid on from Amygdalus communis L.peel hemolysis of erythrocytes

體外抗氧化試驗結果表明，扁桃果皮熊果酸表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，0.06 mg/mL的扁桃果皮熊果酸的還原能力同0.02 mg/mL的VC相當；在0.04～0.10 mg/mL時，扁桃果皮熊果酸與VC對DPPH自由基清除效果接近；當扁桃果皮熊果酸的濃度為0.1 mg/mL時，對·OH清除率為62.11%，低于同濃度VC的；當扁桃果皮熊果酸的濃度為0.6 mg/mL時，對紅細胞氧化溶血抑制率高達97.83%，明顯高于同濃度VC的。

本研究僅對扁桃果皮熊果酸的體外抗氧化活性進行評價，后續(xù)試驗中可對扁桃果皮熊果酸的組織抗氧化和體內小鼠抗氧化作進一步研究。

[1] 孫月娥, 明鳴, 王衛(wèi)東, 等.巴旦木蛋白提取工藝[J].食品科學, 2011, 32(18): 19-23.

[2] 蘭彥平, 吐拉克孜, 郭文英, 等.巴旦杏的研究現(xiàn)狀及開發(fā)利用前景[J].林業(yè)科學研究, 2004, 17(5): 674-679.

[3] 尤努斯江·吐拉洪, 馬木提·庫爾班, 木妮熱·依布拉音.巴旦木的營養(yǎng)保健作用研究進展[J].中國食物與營養(yǎng), 2008, 14(10): 56-58.

[4] 李維霞, 魏佳, 蘇玉紅, 等.高效液相色譜法測定巴旦木青皮提取物中齊墩果酸和熊果酸[J].食品科學, 2016, 37(10): 151-157.

[5] 盧靜, 張博超, 姜瑋, 等.熊果酸抗氧化性能的研究[J].食品工業(yè)科技, 2009(4): 126-127.

[6] ANTONIO E, JUNIOR O D R A, ARAJO I S D, et al.Poly (lactic acid) nanoparticles loaded with ursolic acid: Characterization and in vitro, evaluation of radical scavenging activity and cytotoxicity[J].Materials Science & Engineering C, 2016, 71: 156-166.

[7] MENG Fan-yu, NING Hua, SUN Zong-xiang, et al.Ursolic acid protects hepatocytes against lipotoxicity through activating autophagy via an AMPK pathway[J].Journal of Functional Foods, 2015, 17: 172-182.

[8] JAMAL M, IMAM S S, AQIL M, et al.Transdermal potential and anti-arthritic efficacy of ursolic acid from niosomal gel systems[J].International Immunopharmacology, 2015, 29(2): 361-369.

[9] GU Wen, HAO Yun, ZHANG Guang, et al.Synthesis, in vitro antimicrobial and cytotoxic activities of new carbazole derivatives of ursolic acid[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2015, 25(3): 554-557.

[10] 林科, 張?zhí)? 張鶴云.山楂中熊果酸的提取及其對小鼠的降血脂作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2007, 19(6): 1 052-1 054.

[11] YOON Y, LIM J W, KIM J, et al.Discovery of ursolic acid prodrug (NX-201): Pharmacokinetics and in vivo antitumor effects in PANC-1 pancreatic cancer[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2016, 26(22): 5 524-5 527.

[12] 石瑞, 張寧, 李志英, 等.β-環(huán)糊精超聲輔助提取山楂中熊果酸的研究[J].食品研究與開發(fā), 2016, 37(15): 95-99.

[13] 李瑩, 陳新梅.分光光度法測定大山楂丸中熊果酸含量[J].食品與藥品, 2013, 15(3): 200-201.

[14] 梁俊, 李建科, 趙偉, 等.石榴皮多酚體外抗脂質過氧化作用研究[J].食品與生物技術學報, 2012, 31(2): 159-165.

[15] 江巖, 聶文靜.新疆藥桑椹營養(yǎng)成分分析及其體外抗氧化作用[J].食品科學, 2014, 35(22): 126-129.

[16] 劉玥, 劉曉蘭, 鄭喜群, 等.復合蛋白酶水解玉米谷蛋白產(chǎn)物的抗氧化活性研究[J].食品與機械, 2015, 31(1): 141-145.

[17] 李志平, 張弛, 周維清, 等.巢湖藍藻酸性多糖的理化性質及其體外抗氧化作用[J].食品科學, 2015, 36(5): 7-12.

[18] 陳慧, 盛丹丹, 王文君.黃金茶醇提取物成分及抗氧化活性的研究[J].現(xiàn)代食品科技, 2017(1): 26-32.

[19] 仇燕, 趙爽, 杜占強, 等.菜芙蓉花體外抗氧化活性部位的研究[J].精細化工, 2016, 33(8): 890-895.

[20] 楊艷, 任亞梅, 馬婷, 等.響應面優(yōu)化超聲波提取獼猴桃根熊果酸工藝[J].食品科學, 2014, 35(4): 44-49.

[21] 邵金華, 馬永強, 何福林, 等.虎舌紅多糖超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性評價[J].食品與機械, 2016, 32(12): 166-169.

[22] 郭軍, 王麗麗, 吳小說, 等.西山焦棗中熊果酸超聲法提取工藝研究[J].中國農學通報, 2016, 32(19): 175-181.

[23] 齊娜, 李涵, 張志宇, 等.新疆紅肉蘋果多酚的超聲波輔助提取工藝優(yōu)化[J].食品與機械, 2016, 32(9): 177-182.

[24] 游玉明, 周敏, 王倩倩, 等.花椒麻素的抗氧化活性[J].食品科學, 2015, 36(13): 27-31.

[25] 王金華, 杜超, 梁晨, 等.貴長獼猴桃多糖提取工藝及體外抗氧化功能[J].食品科學, 2016, 37(20): 19-23.

[26] 張津鳴, 鐘筱婷, 盛德喬, 等.資木瓜總黃酮的體內外抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2016, 28(10): 1 602-1 606.