劉林峰

周 陽1,2

林 玲1,2

肖文軍1,2,3

龔志華1,2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

花色苷是植物的主要呈色物質(zhì)[1]?；ㄉ赵诓铇渲芯哂衅毡樾?，是茶樹抗逆生理的表現(xiàn)形式之一[2]?；ㄉ站哂泻芎玫纳锘钚訹3]，成為近年茶葉功能成分研究的熱點。茶樹芽葉中花色苷分析方法迄今還沒有標(biāo)準(zhǔn)，參照其他植物花色苷分析方法[4]，其定性分析方法主要有紙層析、薄層層析、紫外-可見吸收光譜[5]等；定量分析方法主要有單一pH值法、差減法、pH示差法及高效液相色譜法等[6-7]。在眾多方法中，高效液相色譜法具有高靈敏度、分析速度快等突出優(yōu)點，且能與其他分析設(shè)備聯(lián)用，如Eva[8]、Chandra[9]等都曾建立高效液相色譜與其他設(shè)備譜聯(lián)用的方法來分析植物中的花色苷。Sakamoto 等[10]也使用HPLC分析哈斯卡普茶花色苷含量。Lee等[11]用pH示差法和HPLC同時分析了含有花色苷的果汁，建立了2種分析方法的相關(guān)性。中國高效液相色譜分析植物中花青素也有應(yīng)用，如張芳軒[12]、江連洲[13]、李琪[14]、徐學(xué)玲[15]等分別用HPLC分析了黑米種皮、紫甘薯、釀酒葡萄、紫色小白菜中花色苷組分，說明高效液相色譜是當(dāng)下較為普遍的分析植物花色苷的方法。

茶葉花色苷的高效分析方法一直在探索中，也有人用HPLC分析茶葉中花色苷組分，龔加順等[16]采用HPLC分析茶葉中花色苷，初步探究了HPLC分析茶葉花色苷組分。但目前的分析大都是以單一矢車菊為標(biāo)準(zhǔn)品，分析單一的茶樹品種。本研究針對上述問題，擬以3種花色苷外標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品，建立同時分析多種紫芽茶樹花色苷組分的HPLC分析方法，以期為指導(dǎo)紫芽茶樹花色苷組分分析、高純單體的分離鑒定提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樣：紫娟、自選9803、紅芽佛手、安73，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長安實踐教學(xué)基地茶樹資源圃和湖南省茶葉研究所高橋茶樹資源圃，采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽三葉。茶梢冷凍干燥后制成干粉，塑料袋密封后保存于冰箱中，備用。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

1.2.1 藥品試劑

乙腈、磷酸、甲醇、無水乙醇：分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；

標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷：北京譜析科技有限公司；

飛燕草素-葡萄糖苷：西寶生物科技(上海)股份有限公司；

超純水：自制；

酸性乙醇水溶液(85 mL無水乙醇加15 mL 1%鹽酸水)：自配。

1.2.2 儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：SY-2000型，上海亞榮生化儀器廠；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

茶葉揉捻機：40型，浙江上洋機械股份有限公司；

水浴鍋：DSY-2-8型，北京國華醫(yī)療器械廠；

冷凍干燥機：MODULYOD-230型，美國Thermo Fisher Sciebtific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品花色苷的提取與純化 參照文獻[17～18]和預(yù)試驗結(jié)果，采用回流提取的方法提取紫芽茶樹一芽三葉干粉中的花色苷，提取條件為80%乙醇(添加1%冰乙酸水)、1∶50 (g/mL)料液比、80 ℃下回流提取60 min，過濾取濾液，并依次用配比為正己烷∶乙酸乙酯∶水=1∶1∶2(體積比)的溶劑萃取脫脂至有機層無色。水層低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用甲醇定容至2 mL，0.45 μL有機濾膜過膜，裝入進樣瓶中待HPLC 分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 分別取1 mg 3種花色苷標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解定容至10 mL；每種標(biāo)準(zhǔn)品溶液各吸取1 mL 混合定容至10 mL，混合均勻，得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.3.3 茶樹紫芽花色苷HPLC分析方法的建立

(1) 檢測波長的確定：根據(jù)文獻[19]，用紫外分光光度計對3種標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行全波長掃描，選擇最適合的分析波長。

(2) 流動相的優(yōu)化：根據(jù)文獻[20]，控制有機相洗脫梯度為0～55 min、10%～40%，流速 0.8 mL/min，柱溫 30 ℃和紫外檢測波長 520 nm等其他色譜條件不變，按照表1方案，選用的流動相不同配比，分析比較流動相對樣品分離度及柱效的影響。

表1 不同流動相設(shè)計方案Table 1 Designs of different mobile phases

(3) 洗脫梯度的調(diào)節(jié)：根據(jù)文獻[7]，以乙腈和0.2%磷酸超純水作流動相梯度洗脫，控制流速 0.8 mL/min，柱溫 30 ℃，紫外檢測波長 520 nm等色譜條件不變，按表2方案，分析不同洗脫梯度下的樣品分離度及柱效情況，選擇最優(yōu)的洗脫梯度。

表2 不同洗脫程序設(shè)計方案Table 2 Designs of different elution procedures

(4) 流速的選擇：根據(jù)文獻[20]，以乙腈和0.2%磷酸超純水作流動相梯度洗脫，控制有機相洗脫梯度為0～55 min、10%～40%，柱溫 30 ℃，紫外檢測波長 520 nm等其他色譜條件不變，分析流速(0.8，1.0，1.2 mL/min)對樣品分離度及柱效的影響。

(5) 柱溫的選擇：根據(jù)文獻[20]，以乙腈和0.2%磷酸超純水作流動相梯度洗脫，控制有機相洗脫梯度為0～55 min、10%～40%，流速 0.8 mL/min，紫外檢測波長 520 nm等其他色譜條件不變，分析柱溫(20，25，30 ℃)對樣品分離度及柱效的影響。

1.3.4 方法學(xué)考察

(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將1.3.2配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液過膜，用1.3.3中獲得的最優(yōu)色譜條件分別進樣5，10，15，20，25，50 μL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2) 精密度分析：分別配制3種標(biāo)準(zhǔn)品，分別在最優(yōu)色譜條件下同日內(nèi)5個不同時間點進行進樣分析，由測得的面積(A)計算標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，獲得日內(nèi)精密度值。

(3) 重復(fù)性分析：按1.3.1的方法，4種紫芽茶樹用同一批茶樣制備6份不同花色苷提取液在最優(yōu)色譜條件下進樣，由測得的面積(A)計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，分析重復(fù)性。

(4) 穩(wěn)定性分析：配制3種標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫靜置，分別于0，2，4，6，8，12，24 h進樣，由測得的面積(A)分析溶液穩(wěn)定性。

(5) 樣品回收率分析：稱取 6份已測定了花色苷含量的茶樣1 g，按1.3.1 方法制備供試溶液，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)液，在最優(yōu)色譜條件下進樣，重復(fù)6次，分析樣品回收率。

1.3.5 紫芽茶樹茶梢樣品花色苷液相色譜法含量分析 按照1.3.1制備4種茶樣待測液，進樣10 μL，重復(fù)3次，計算茶樣中花色苷含量。計算公式：

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的確定 通過HPLC中全波長掃描可知(圖1)，飛燕草素的紫外最大吸收波長在275，524 nm左右，矢車菊素的紫外最大吸收波長在281，516 nm左右，天竺葵素的最大吸收波長在266，513 nm左右，要同時測定3種標(biāo)準(zhǔn)品以及樣品中的花色苷，考慮到各組分的靈敏度并避免其他多酚組分干擾，選擇520 nm波長作為檢測波長較為合適。

圖1 3種標(biāo)準(zhǔn)品紫外可見光譜圖Figure 1 UV-visible spectrums of three standard products

2.1.2 流動相的優(yōu)化 如圖2所示，甲醇、50%乙腈、乙腈均可實現(xiàn)各花色苷成分的分離，考慮到乙腈洗脫能力更強，故選擇乙腈為有機相。水相磷酸濃度對組分分離影響不大，但在水中加入一定體積的酸，調(diào)節(jié)流動相的酸堿度可達到減少小峰拖尾和提高分離度的效果，故選擇0.2%磷酸水做水相。綜上，選擇方案4為最佳流動相方案。

圖2 不同流動相方案HPLC圖Figure 2 HPLC chromatograms of different mobile phase solutions

2.1.3 洗脫梯度的調(diào)節(jié) 如圖3所示，方案1和方案2有機相比率過高，各組分分離度相對較差，方案3耗時過長，與方案4相比效率過低，綜合來說方案4花色苷組分分離度和分離效率最佳，故選擇方案4，即有機相洗脫梯度為：0～55 min，10%～40%為最佳洗脫方案。

2.1.4 流速的選擇 不同流速方案的HPLC圖見圖4。結(jié)果表明，流速越快，雖然會使目標(biāo)物質(zhì)的分離時間相對縮短，但樣品各組分分離度降低，故選擇0.8 mL/min為最適流速。

2.1.5 柱溫的選擇 不同柱溫方案的HPLC圖見圖5。結(jié)果表明，柱溫越高，色譜分析出峰時間會更快，但高柱溫HPLC調(diào)節(jié)柱溫耗時過多，故選擇相對效率較好的30 ℃為系統(tǒng)柱溫。

圖3 不同洗脫程序方案HPLC圖Figure 3 HPLC chromatograms of different elution procedures

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作與檢出限 以進樣量為x軸，峰面積為y軸，繪制花色苷混合標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表3。由表3可知，在5～75 μg/L范圍內(nèi)，3種標(biāo)準(zhǔn)品都表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

表3 不同花色苷標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系表Table 3 Linear relationship of different anthocyanin standards

圖4 不同流速方案HPLC圖Figure 4 HPLC chromatograms of different flow rate

圖5 不同柱溫方案HPLC圖Figure 5 HPLC chromatograms of different column temperature

2.2.2 精密度分析 由表4可知，在520 nm波長下，3種標(biāo)準(zhǔn)品的RSD都在8%內(nèi)，表明本方法精密度良好。

表4 精密度分析結(jié)果Table 4 Results of precision analysis

2.2.3 重復(fù)性分析 由表5可知，在520 nm波長下，4種紫芽茶樹樣品中總花色苷的RSD均在9.04%之內(nèi)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性分析 由表6可知，室溫靜置下，520 nm波長下飛燕草素、矢車菊素和天竺葵素的RSD均≤9%，表明本方法穩(wěn)定性良好。

2.2.5 回收率分析 由表7可知，3種外標(biāo)花色苷在本方法下加標(biāo)回收率為75%～88%，到達色譜分析要求，說明本方法結(jié)果可靠。

2.3 紫芽茶樹茶葉樣品中花色苷含量的檢測

根據(jù)1.3.1中的方法等到的茶樹花色苷溶液，按1.3.5的方法重復(fù)3次，不同茶樣中花色苷含量，結(jié)果見表8和圖6。由HPLC色譜圖可以看出，4種紫芽茶樹樣品中的7種主要花色苷均得到有效分離。從結(jié)果可以看出不同茶樹品種(系)所富集的花色苷含量存在顯著差異，花色苷含量的高低表現(xiàn)為紫娟>自選9803>安73>紅芽佛手，與紫芽茶樹品種(系)芽葉發(fā)紫程度的深淺基本一致，說明此方法適合分析紫芽茶樹中花色苷含量。

表5 重復(fù)性分析結(jié)果Table 5 Results of repeatability analysis

表6 穩(wěn)定性分析結(jié)果Table 6 Results of stability analysis

表7 回收率分析結(jié)果Table 7 Results of recovery analysis

3 結(jié)論

本研究利用高效液相色譜法建立了同時檢測4種紫芽茶樹花色苷組分的HPLC分析方法：茶梢樣品先經(jīng)酸性80%乙醇水回流提取、正己烷和乙酸乙酯脫脂，然后采用 C18色譜柱，以乙腈和0.2%磷酸超純水作流動相梯度洗脫，有機相洗脫梯度為0～55 min、10%～40%，流速 0.8 mL/min，柱溫 30 ℃，紫外檢測波長 520 nm，4種紫芽茶樹品種(系)中各花色苷組分和標(biāo)準(zhǔn)品在本方法下分離效果良好，相關(guān)系數(shù)均≥0.99，線性范圍為 5.00～75.00 μg/L，樣品加標(biāo)回收率為75%～88%，該方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值≤10%。紫芽茶樹檢測結(jié)果表明，花色苷含量的高低表現(xiàn)為紫娟>自選9803>安73>紅芽佛手，與紫芽茶樹品種(系)芽葉發(fā)紫程度的深淺基本一致。

表8 不同樣品花色苷含量差異Table 8 Analysis of anthocyaninscontents in different samples (n=3)

圖6 不同品種樣品和混合標(biāo)樣的花色苷HPLC色譜圖Figure 6 Comparison of anthocyanin components differences in different tea varieties and mixed standard

本研究使用的C18為常見色譜柱，購買方便，流動相為乙腈和磷酸水，容易配制，同時也降低了對試驗儀器的要求，可用于同時檢測分析矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷、飛燕草素-葡萄糖苷3種植物花色苷和紫芽茶樹中多種花色苷組分。

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