章 梅ZHANG Mei

宋元達(dá)1,2

劉 青1,2

王友玲1,2

吳 翰1,2

(1.山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000；2.山東省高校農(nóng)產(chǎn)品功能化技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 淄博 255000)

阿維拉霉素又名肥拉霉素，是一種正糖霉素族的寡糖類抗生素，具有調(diào)節(jié)動物腸內(nèi)細(xì)菌代謝[1-2]和促進(jìn)動物生長的作用[3]。阿維拉霉素對革蘭氏陽性菌具有較好的抑制效果，對大腸桿菌有著間接的影響，能有效地減小動物的感染率[4]，還可以促進(jìn)動物生長、提高飼料回報率同時具有低殘留和低毒性、無交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)作為一種飼料添加劑用于豬和肉雞的養(yǎng)殖[5-6]。

阿維拉霉素的生產(chǎn)是好氧發(fā)酵過程，發(fā)酵液中溶氧水平的高低與細(xì)胞內(nèi)酶的活性有著直接的關(guān)系，決定了何種代謝途徑生成 ATP、還原力及各種代謝物[7]；對細(xì)胞的生長和細(xì)胞內(nèi)阿維拉霉素的合成有重大影響。為了滿足發(fā)酵過程中氧的要求，常用攪拌轉(zhuǎn)速和增大通氣量等方法來提高發(fā)酵液中溶氧水平，但過大的剪切力會引起菌絲損傷，造成菌絲斷裂、泡沫增多和變大以及發(fā)酵不易控制等[8]。也有學(xué)者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將透明顫菌血紅蛋白的基因克隆到目的菌株，降低菌株對氧的敏感度，使菌株適應(yīng)發(fā)酵液中較低的溶氧水平，提高對氧的利用[9]；向發(fā)酵液中加入過氧化氫等[10]分子氧底物。以上2種方法存在基因的表達(dá)不穩(wěn)定或丟失[11]和本身有著較大毒性等[12]問題。通過添加氧載體來改善發(fā)酵液的溶氧水平，也能提高發(fā)酵產(chǎn)量[13]。

氧載體是一種對細(xì)胞沒有毒性，具有比水更高的溶氧能力的有機(jī)化合物[14]。在發(fā)酵液中添加正己烷、煤油和表面活性劑等氧載體，引入新的液相，減小氣液之間的傳氧阻力，提高Kla(傳氧系數(shù))值，在同一發(fā)酵系統(tǒng)中能提高30%～300%，或達(dá)到同樣混合效果時降低攪拌功率 30% 以上[15]。目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)有氧載體用于發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的研究。本試驗(yàn)擬研究各種氧載體對綠色產(chǎn)色鏈霉菌產(chǎn)阿維拉霉素的影響，進(jìn)一步觀察其發(fā)酵參數(shù)，對氧載體的效果進(jìn)行評價和篩選，并考察添加時間和濃度對生物量及阿維拉霉素合成的影響，以期為氧載體在阿維拉霉素工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

綠色產(chǎn)色鏈霉菌(S.viridochromogene LY013)：浙江凌云藥業(yè)有限公司。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要試劑

Avilamycin標(biāo)準(zhǔn)品：80%，美國歷來公司；

吐溫20、吐溫80：分析純，上海滬試劑廠；

正己烷：分析純，上海沃凱生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 主要儀器

超凈工作臺：ZHJH-C1115C型，上海智城分析儀器制造有限公司；

隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GRP-9160型，上海森信儀器有限公司；

液相色譜儀：waters600e型，沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

1.3.1 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KNO31.0 g/L、FeSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、瓊脂 20.0 g/L，pH 7.2～7.4；

種子培養(yǎng)基：豆餅粉 32 g/L、甘露醇 22 g/L、蛋白胨 5 g/L、葡萄糖 10 g/L、NaCl 5 g/L、(NH4)2SO4、6.4 g/L、MgSO40.05 g/L，pH 7.2～7.4；

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘露醇 25 g/L、豆餅粉 34 g/L、可溶性淀粉 6.4 g/L、(NH4)2SO42.5 g/L、葡萄糖 2 g/L、MgSO40.05 g/L、CaCO35 g/L，pH 7.2～7.4。

1.3.2 培養(yǎng)方法

液體種子培養(yǎng)：挑選斜面培養(yǎng)基中長勢較好的綠色產(chǎn)色鏈霉菌的孢子，接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶內(nèi)。在28 ℃的搖床里以 200 r/min 振蕩培養(yǎng) 24 h；

液體發(fā)酵培養(yǎng)：以 6%的接種量，將已培養(yǎng)種子培養(yǎng)液接入到裝有50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28 ℃ 條件下200 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h。

1.4 分析方法

1.4.1 樣品處理 取5.0 mL發(fā)酵液于離心管中，4 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入9.0 mL無水甲醇，用振蕩器充分振蕩后，浸提30 min，用濾膜過濾，經(jīng)無水甲醇稀釋的上清液即為待測液。

1.4.2 菌體生物量的測定 在發(fā)酵48 h后，吸取發(fā)酵液10 mL，4 000 r/min離心10 min，倒出上清液，沉淀物烘干至恒重的質(zhì)量即為菌體生物量。

1.4.3 還原糖的測定 采用DNS法[16]。

1.4.4 阿維拉霉素的測定 取1 mL的發(fā)酵液移至裝有3 mL 甲醇的5 mL的離心管中，旋渦震蕩3 min，超聲10 min 后經(jīng)0.22 μm過濾膜過濾，搖勻，備用。

采用高效液相色譜分析(HPLC)法。色譜條件：流動相為乙腈∶0.2%磷酸二氫銨=51∶49(體積比)；流速1 mL/min；色譜柱Agilent C18，4.6 mm×250 mm；檢測波長214 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20.0 μL。

1.4.5 得率系數(shù)的計算 按式(1)計算得率系數(shù)。

(1)

式中：

R——得率系數(shù)，mg/g；

M——阿維拉霉素，mg/L；

DCW——生物量，g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧載體對阿維拉霉素的影響

選擇7種常用氧載體以2 g/L的添加量進(jìn)行綠色產(chǎn)色鏈霉菌發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，添加氧載體均可以提高阿維拉霉素的產(chǎn)量。其中吐溫20、吐溫80、正己烷的效果明顯；其余的氧載體也有一定的促進(jìn)作用，但與前3組比較，效果不顯著。與對照組相比，正己烷提高了21 mg/L，吐溫 20提高了26 mg/L，吐溫80的促進(jìn)效果最好，增加了40 mg/L。顯然吐溫對阿維拉霉素的合成具有較好的促進(jìn)效果，從促進(jìn)效果和經(jīng)濟(jì)性角度綜合考慮，選擇正己烷、吐溫20和吐溫80作為研究對象，進(jìn)一步研究其對阿維拉霉素產(chǎn)量的促進(jìn)作用。

圖1 氧載體對阿維拉霉素產(chǎn)量的影響Figure 1 Effect of different oxygen-vectors on the yield of avilamycin

2.2 氧載體添加量對發(fā)酵的影響

2.2.1 吐溫20、吐溫80和正己烷添加量對阿維拉霉素產(chǎn)量的影響 由圖2可知，添加量低于3 g/L時，隨著氧載體添加量的增加，阿維拉霉素產(chǎn)量也隨著增加。添加量為3 g/L時，阿維拉霉素產(chǎn)量均達(dá)到最高。吐溫80的提升效果要優(yōu)于吐溫20與正己烷的。當(dāng)添加量超過3 g/L時，阿維拉霉素產(chǎn)量均有所減小，說明過高濃度的氧載體對菌生產(chǎn)阿維拉霉素不利，可能是氧的濃度對抗生素的產(chǎn)量影響降低。其中添加量為3～4 g/L時正己烷組產(chǎn)量下降較快，可能是高濃度的正己烷影響了阿維拉霉素相關(guān)酶系導(dǎo)致產(chǎn)量下降[17]。高濃度的氧載體能提高Kla系數(shù)[18]，提高發(fā)酵液的溶氧水平，促進(jìn)阿維拉霉素產(chǎn)量的提高，但是過高濃度氧載體卻不利于綠色產(chǎn)色鏈霉菌的發(fā)酵，使得發(fā)酵液中阿維拉霉素含量降低。

2.2.2 吐溫20、吐溫80和正己烷添加量對生物量的影響

圖3顯示，在添加量為3 g/L時菌體量達(dá)到最大值，添加正己烷、吐溫80和吐溫20的發(fā)酵液生物量與對照組生物量(9.80 g/L)相比，分別提高了15.58%，20.63%，16.58%。與正己烷組相比，吐溫80對生物量促進(jìn)的效果更為明顯。

圖2 正己烷、吐溫20和吐溫80添加量對阿維拉霉素產(chǎn)量的影響Figure 2 Effect of different n-hexane, Tween-20 and Tween-80 concentration on the yield of avilamycin

圖3 正己烷、吐溫20和吐溫80添加量對生物量的影響Figure 3 Effect of different n-hexane, Tween-20 and Tween-80 concentration on dry weight of cells

這可能是吐溫80本身就可以作為營養(yǎng)源，供給微生物生長，而且吐溫可以增大細(xì)胞的通透性，使細(xì)胞的新陳代謝較為容易[19]，從而促進(jìn)了細(xì)胞的生長，提高了生物量。同時發(fā)現(xiàn)添加量超過3 g/L時，正己烷、吐溫20和吐溫80組的生物量都有所降低。其中正己烷組的生物量下降速度較快，可能是由于高濃度烷烴類氧載體對菌體的傷害較強(qiáng)，使得菌絲體在發(fā)酵后期快速降解[20]，與馮杰等[21]研究結(jié)果相符。說明氧載體的濃度過高不利于菌體量的增長，同時會干擾微生物的發(fā)酵，抑制菌體合成次生代謝產(chǎn)物的能力，造成單位菌體產(chǎn)阿維拉霉素能力下降。

2.2.3 吐溫20、吐溫80和正己烷添加量對得率系數(shù)的影響

由圖4可知，添加不同氧載體的發(fā)酵液中得率系數(shù)的趨勢大致相同，添加0～2 g/L時隨著氧載體濃度的提高，正己烷、吐溫20和吐溫80組的菌體得率系數(shù)逐漸增大，說明低濃度氧載體均有利于單位細(xì)胞產(chǎn)阿維拉霉素的能力提高。比較圖2～4的數(shù)據(jù)可知，添加量為2～3 g/L時，添加氧載體能促進(jìn)阿維拉霉素的產(chǎn)量和生物量的提高，與顏日明等[22]的研究結(jié)果相同，但阿維拉霉素的得率系數(shù)基本維持不變甚至有所降低，說明產(chǎn)量的增加與生物量的提高有很大關(guān)系，不僅僅是單位細(xì)胞產(chǎn)率增大的結(jié)果。添加量超過3 g/L 時，3種氧載體的得率系數(shù)、生物量和產(chǎn)量都沒有提高，甚至有所降低。這可能是菌體在生長階段和代謝階段受到的限制主要因素不僅僅是氧濃度，還受到發(fā)酵本身的碳源和氮源限制。

圖4 正己烷、吐溫20和吐溫80添加量對得率系數(shù)的影響Figure 4 Effect of n-hexane, Tween-20 and Tween-80 concentration on dry weight of cells and the yield of avilamycin

2.3 吐溫20、吐溫80和正己烷添加時間對阿維拉霉素產(chǎn)量的影響

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以3 g/L的添加量進(jìn)一步研究氧載體在發(fā)酵過程中的添加時間對阿維拉霉素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，發(fā)酵后24 h內(nèi)添加氧載體比發(fā)酵開始時添加能顯著提高阿維拉霉素產(chǎn)量；前8 h，隨著添加時間的推遲，阿維拉霉素的產(chǎn)量整體呈上升趨勢，提示氧載體最適的添加時間為鏈霉菌的對數(shù)生長期，可能是菌體在對數(shù)生長期對氧的要求較高，添加氧載體解除溶氧極限，有利于菌體的生長；而在發(fā)酵后期(24 h后)添加氧載體，隨著添加時間推遲，阿維拉霉素的產(chǎn)量低于發(fā)酵初始添加，這是因?yàn)檫M(jìn)入生長穩(wěn)定期，氧載體的添加對菌體量的促進(jìn)效果減低。另外吐溫組的產(chǎn)量超過了正己烷組，可能是氧載體吐溫80對生物量有明顯提升效果，與王爽等[19]的研究結(jié)果一致。但是抗生素是次級代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量的高低受多種因素影響，菌體量只是其中的一個方面；液態(tài)烷烴在發(fā)酵液中可以起到分散劑的作用，使細(xì)胞間的絮凝性降低，較大的菌絲團(tuán)在剪切力的作用下會分散成數(shù)個小菌絲團(tuán)。與大菌絲團(tuán)相比，分散的較小菌絲團(tuán)界面面積會有所增加，從而加快了氧傳遞到菌絲體內(nèi)的總速度。但是烷烴較高的毒性會抑制菌體產(chǎn)抗生素的能力，降低阿維霉素的產(chǎn)量。

圖5 正己烷、吐溫20和吐溫80添加時間對阿維拉霉素產(chǎn)量的影響Figure 5 Effect of n-hexane, Tween-20 and Tween-80 concentration addition time on and avilamycin production

2.4 吐溫80對阿維拉霉素發(fā)酵過程的影響

以吐溫80為氧載體，添加時間為8 h、添加量為3 g/L進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，其發(fā)酵過程中綠色產(chǎn)色鏈霉菌的生物量、產(chǎn)量、培養(yǎng)基pH值、殘?zhí)呛康淖兓厔菀妶D6。由圖6可知，添加氧載體能加快菌體的生長，提高生物量，并提高了單位菌體產(chǎn)阿維拉霉素的能力，兩者共同作用促使阿維拉霉素產(chǎn)量顯著提高。在0～16 h菌體的對數(shù)生長期，發(fā)酵液中阿維拉霉素的含量較低，pH值和還原糖的含量都急劇下降；在16 h后，生物量逐漸保持穩(wěn)定，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期，并保持不變，而阿維拉霉素的含量呈指數(shù)上升，并在40 h達(dá)到最大值，這種發(fā)酵類型屬于非生長偶聯(lián)型發(fā)酵；同時發(fā)酵液中pH值由發(fā)酵早期的逐漸減小轉(zhuǎn)變?yōu)橹饾u增大，還原糖的消耗速率也有著明顯的降低，可能與菌體在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸有關(guān)[20]。葡萄糖經(jīng)EMP途徑等生成的有機(jī)酸被部分排出細(xì)胞外，使得發(fā)酵液的有機(jī)酸含量增高，pH值下降，但在阿維拉霉素生產(chǎn)期，由于發(fā)酵液中碳源量的降低，有機(jī)酸被菌體重新利用[23-25]，pH值逐漸上升；同時菌體進(jìn)入次生代謝期，生物量不再增加，還原糖的消耗速率也逐漸減小，阿維拉霉素含量也急劇上升[26]。因此在8 h發(fā)酵的對數(shù)生長期添加吐溫80解除溶氧限制，能提高生物量和阿維拉霉素的產(chǎn)量[27-28]。

圖6 發(fā)酵過程中pH、還原糖、生物量、阿維拉霉素的曲線圖Figure 6 The curve of pH, deoxidize sugar, Biomass, avilamycin during fermentation

3 結(jié)論

本研究將7種氧載體添加到綠色產(chǎn)色鏈霉菌的發(fā)酵過程中，結(jié)果顯示添加的氧載體均可以提高其阿維拉霉素的產(chǎn)量，其中吐溫20、正己烷和吐溫80效果最好。在此基礎(chǔ)上考察這3種氧載體對綠色產(chǎn)色鏈霉菌合成阿維拉霉素的影響，發(fā)現(xiàn)3種氧載體均可以提高生物量，同時能提高綠色產(chǎn)色鏈霉菌的得率系數(shù)，從而提高綠色產(chǎn)色鏈霉菌產(chǎn)阿維拉霉素的能力，其中吐溫80作為氧載體的效果最好。另外，還研究了氧載體添加時間對阿維拉霉素產(chǎn)量的影響，在發(fā)酵開始的第 8天添加 3 g/L 的吐溫80與對照組相比，生物量提高了20.63%，得率系數(shù)增加到3.12%。

本試驗(yàn)證明了氧載體能強(qiáng)化氧傳遞速率，提高菌體的生物量和得率系數(shù)，促進(jìn)代謝產(chǎn)物的合成。下一步將研究各種氧載體的協(xié)同作用對阿維拉霉素產(chǎn)量提高的影響以及對菌體糖代謝的關(guān)鍵酶活性的影響，進(jìn)一步發(fā)掘氧載體的促進(jìn)機(jī)制。

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