劉國鋒LIU Guo-feng

(1.湖南尤特爾生化有限公司，湖南 岳陽 414000；2.山東尤特爾生物科技有限公司，山東 鄒城 273500)

木聚糖酶(1,4-β-D-xylan xylanohydrolase，EC.3.2.1.8)是一類木聚糖降解酶系，屬于水解酶類。木聚糖酶主要包括：內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。狹義上的木聚糖酶是指β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶[1-2]。木聚糖酶可用于生物乙醇的生產(chǎn)，在食品、飼料等行業(yè)中也有著廣泛的應(yīng)用[3]。

木聚糖酶是飼料主要用酶之一，其主要作用是分解由五碳糖聚合而成的半纖維素和木聚糖，主要分解產(chǎn)物有木糖、木二糖、木三糖和少量的阿拉伯糖。在食品工業(yè)中木聚糖酶也有著比較廣泛的應(yīng)用，在面包加工過程中添加適量的木聚糖酶不僅能提高面團(tuán)的機(jī)械加工性能，還可以消除發(fā)酵過度的影響，增大面包體積，改善面包芯質(zhì)地以及延緩老化[4]。另外，近年來木聚糖酶廣泛用于酶法生產(chǎn)低聚木糖上，作為功能性低聚糖的一種，低聚木糖在保健食品和醫(yī)藥行業(yè)有廣泛的應(yīng)用前景，對高脂血癥有很好的治療效果，能有效地降低血壓、血清膽固醇[5]。目前，對木聚糖酶的研究側(cè)重于高產(chǎn)木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建、木聚糖酶誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化、木聚糖酶功能基因的鑒定及比較等方面[6-8]。中國生產(chǎn)木聚糖酶的廠家較少，因酶活力單位較低，質(zhì)量不穩(wěn)定，木聚糖酶產(chǎn)品主要依靠進(jìn)口。因此開發(fā)高活性的木聚糖酶對打破國外廠家壟斷、提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益方面具有廣闊的前景。本試驗(yàn)擬在前期研究[9]的基礎(chǔ)上，對工程菌產(chǎn)木聚糖酶提取工藝進(jìn)行探究，并對獲得的木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為木聚糖酶工業(yè)化大生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大腸桿菌工程菌發(fā)酵液：湖南尤特爾生化有限公司；

丙烯酸樹脂：生化試劑，遼寧三環(huán)樹脂有限公司；

中空纖維膜：PWSW-543(0.1 μm，0.08 m2)、UMP153(0.2 μm，0.08 m2)、ULP143 (0.45 μm，0.1 m2)，頗爾過濾器(北京)有限公司；

陶瓷膜、陶瓷超濾膜管單孔道(0.2 μm，0.08 m2)：合肥世杰膜工程有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

精密pH計：雷磁PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

水分快速測定儀：SH10AD型，上海良平儀器有限公司；

濁度測定儀：XZ-0101型，上海海恒機(jī)電儀表有限公司；

管式連續(xù)流離心機(jī)：GQ145WZ型，上海佳毅機(jī)械設(shè)備公司；

板框壓濾機(jī)：1000型，佛山金凱地過濾設(shè)備有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH-8型，常州國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生產(chǎn)工藝流程

大腸桿菌→搖瓶種子→小罐種子→發(fā)酵罐發(fā)酵→細(xì)胞破碎→中空纖維膜過濾→超濾濃縮→固液混合→搖擺造粒→拋丸→烘干→篩分→包衣→配制→檢驗(yàn)→包裝→成品

1.2.2 酶的提取工藝

(1) 珠磨法提取木聚糖酶的工藝：將發(fā)酵液冷卻至18 ℃ 后，以同一進(jìn)料速度連續(xù)流入DYNO-mill ECM珠磨機(jī)中，在不同直徑大小的研磨珠及其裝填系數(shù)下進(jìn)行細(xì)胞破碎，檢測破碎液酶活。以實(shí)驗(yàn)室超聲波破碎發(fā)酵液測得的酶活為參照，按式(1)計算細(xì)胞破碎率。

(1)

式中：

C1——細(xì)胞破碎率，%；

U1——珠磨機(jī)破碎液酶活，IU；

U2——超聲波破碎液酶活，IU。

(2) 膜分離設(shè)備選型及工藝參數(shù)優(yōu)化：選用PWSW-543(0.1 μm，0.08 m2)、UMP153(0.2 μm，0.08 m2)、ULP143 (0.45 μm，0.1 m2) 3種型號的膜柱，采用恒壓過濾模式進(jìn)行酶制劑澄清過濾。

膜柱化學(xué)清洗方法：試驗(yàn)結(jié)束后，用冷水、55 ℃熱水沖洗，再使用1%的堿+300 mg/L過氧化氫在55 ℃清洗10 min。清洗完畢后，通過中空纖維膜柱水通量恢復(fù)率來考察中空纖維膜堵塞程度，濁度用濁度測定儀測定。

(3) 超濾濃縮木聚糖酶的工藝研究：將截留分子量為5 000，8 000，10 000，20 000 D聚醚砜(PES)卷式超濾膜分別裝入超濾機(jī)中，取適量的中性木聚糖酶倒入超濾桶中，在20 ℃ 同條件下進(jìn)行濃縮。分別測定超濾透過液酶活、濃縮液酶活，按式(2)計算超濾收率。

(2)

式中：

C2——超濾收率，%；

U3——超濾透過液酶活，IU；

U4——濃縮液酶活，IU。

(4) 固態(tài)腸溶木聚糖酶包衣材料選擇：在槽型混合機(jī)中將濃縮酶液、玉米淀粉、糊精、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉按照一定比例混合均勻，送入搖擺式顆粒機(jī)進(jìn)行搖擺造粒。將成型后的顆粒使用拋丸機(jī)拋圓。將拋圓后的光滑小丸用沸騰干燥制粒機(jī)在50 ℃下干燥。將干燥后的小丸用振動篩分選出30～80目的小丸。將不同型號的聚丙烯樹脂放入95%酒精中，按1∶20的質(zhì)量比混合配制成腸溶包衣材料。將分選出的小丸放入旋流流化床包衣機(jī)中，用包衣機(jī)配槍把配制的不同腸溶包衣材料均勻噴灑到小丸上，50 ℃下干燥制得固態(tài)腸溶木聚糖酶。將腸溶酶置于80 ℃ 5 min、pH 2.5磷酸緩沖液120 min、pH 5.5磷酸緩沖液15 min條件下測酶活。

1.2.3 酶學(xué)性質(zhì)的研究

(1) 木聚糖酶最適pH值和最適溫度的確定：測定木聚糖酶在不同pH(3.2～9.6)及不同溫度(35～70 ℃)條件下的酶活。酶活力單位(IU)規(guī)定為：溫度50 ℃、pH 6.5條件下，每分鐘從濃度為5.0 mg/mL的櫸木木聚糖溶液中產(chǎn)生1 μmol 還原糖所需要的酶量，還原糖(采用斐林法測定[10])以木聚糖含量計。木聚糖酶酶活的測定：參照文獻(xiàn)[11]。

(2) 酶的熱穩(wěn)定性測定：將酶液分別在40，50，60，70 ℃水浴中放置不同時間后，在pH 6.5、50 ℃條件下測定酶活。準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品，加入10 mL水(加水后總含水量17%)，充分?jǐn)嚢韬笊w嚴(yán)，于90 ℃恒溫干燥箱處理2.5，5.0，7.5，10.0 min，立即提取，在pH 6.5、50 ℃條件下測定酶活。

(3) 木聚糖酶降解產(chǎn)物研究：用薄層色譜法鑒定pH 6.5、50 ℃條件下燕麥木聚糖經(jīng)木聚糖酶降解后的產(chǎn)物種類。

2 結(jié)果與討論

2.1 珠磨法工藝參數(shù)優(yōu)化

胞內(nèi)產(chǎn)物的提取首先需要對細(xì)胞進(jìn)行破碎，細(xì)胞破碎方法的選擇直接影響產(chǎn)品品質(zhì)及生產(chǎn)成本。近年來常用的幾種細(xì)胞破碎方法有高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎、酶溶法及化學(xué)滲透法[12]。本研究采用高速珠磨法。

從表1可以看出，在相同裝填系數(shù)條件下，研磨珠直徑越小，破碎率越高，但電能消耗也遞增。在相同直徑條件下，研磨珠裝填系數(shù)越高，破碎率越高，但電能消耗也遞增。選擇第5組工藝參數(shù)，破碎效果較好，生產(chǎn)能耗也相對較低。

表1研磨珠直徑及裝填系數(shù)對破碎效果的影響
Table 1 The effect of the grinding bead diameter and filling coefficient on the breaking effect

在實(shí)際生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞破碎次數(shù)越多，細(xì)胞破碎率越高，但不是無限增大的。當(dāng)破碎1次后破碎近乎完全時，考慮到經(jīng)濟(jì)性和避免生產(chǎn)操作的復(fù)雜，再增加破碎次數(shù)是不必要的，因此選擇破碎1次。

2.2 固液分離方法選擇

在固液分離過程中，工業(yè)上常用的設(shè)備有離心機(jī)、板框壓濾機(jī)、真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)及膜過濾系統(tǒng)[13]。本研究選用管式連續(xù)流離心機(jī)(10 000 r/min)、板框壓濾機(jī)、陶瓷膜系統(tǒng)、中空纖維膜系統(tǒng)對細(xì)胞破碎液進(jìn)行初步測試，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，選用陶瓷膜系統(tǒng)和中空纖維膜系統(tǒng)處理細(xì)胞破碎液比較好。另外，膜過濾系統(tǒng)還能達(dá)到一次性過濾澄清物料并去除細(xì)菌的效果。

2.3 膜分離方法選擇

在前面的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按照1.2.2(2)對細(xì)胞破碎液進(jìn)行進(jìn)一步過濾測試，結(jié)果見表3。

從表3可以看出，陶瓷膜孔徑受加工精度的影響，透過液可以檢測出細(xì)菌，其濾出液酶活較同孔徑大小的中空纖維膜透過液酶活低。另外，在酶的收率方面，選用陶瓷膜的收率只有75%，小于中空纖維膜的，主要是陶瓷膜系統(tǒng)運(yùn)行所需壓力較中空纖維膜系統(tǒng)高，酶受剪切力作用大，導(dǎo)致陶瓷膜系統(tǒng)所得收率較中空纖維膜系統(tǒng)收率小。

表2 幾種固液分離方法初步測試結(jié)果Table 2 The initial test results of several kinds of solid-liquid separation method

為進(jìn)一步選擇合適的中空纖維膜型號，按照1.2.2(2)分別進(jìn)行了測試，結(jié)果見表4和圖1、2。

從表4和圖2中可以看出，中空纖維膜膜柱UMP153和膜柱ULP143在恒定過膜壓力0.05 MPa條件下過濾酶液，實(shí)際過濾時間分別為1 h 43 min和1 h 5 min，平均通量分別為10.9，16.6 L/(m2·h)。膜柱經(jīng)過清洗后，水通量恢復(fù)率分別為94%，100%?？梢?，膜柱ULP143過濾酶液，收率高，通量理想，透過液質(zhì)量滿足控制要求。膜柱采用冷水、55 ℃熱水、55 ℃ 1%的堿液+300 mg/L 過氧化氫上下游同時清洗工藝，可恢復(fù)濾膜水通量。因此，后續(xù)生產(chǎn)中選用膜柱ULP143中空纖維膜用于固液分離工段。

? “-”表示細(xì)胞破碎液濁度超過儀器檢測上限。

表4 膜柱UMP153及膜柱ULP143測試結(jié)果?Table 4 The test results of film column UMP153 and film column ULP143

? “-”表示細(xì)胞破碎液濁度超過儀器檢測上限。

圖2 UMP153和ULP143過濾過程通量、溫度隨透過液體積的變化趨勢Figure 2 The variation trend of flux and temperature with the volume of penetration liquid in the UMP153 and ULP143 filtration process

2.4 酶液濃縮方法選擇及工藝參數(shù)優(yōu)化

工業(yè)生產(chǎn)上常用的酶液濃縮方法有鹽析法、冷凍干燥濃縮法、真空薄膜濃縮法、超濾膜濃縮法[14]。從能耗、環(huán)保、提取收率及生產(chǎn)操作等方面考慮，采用超濾膜濃縮法用于工業(yè)化大生產(chǎn)。本研究中，木聚糖酶分子量為30 kD，選用不同超濾膜孔徑進(jìn)行濃縮測試，結(jié)果見表5。

從表5可以看出，超濾膜PES20透過的廢液通量最大，但廢液酶活也最高，提取收率受到影響。超濾膜PES5透過的廢液酶活最低，但廢液通量最小，因酶液循環(huán)次數(shù)多酶蛋白受超濾系統(tǒng)剪切力破壞多，提取收率受到較大影響。超濾膜PES10超濾濃縮酶液，透過的廢液酶活、通量及超濾收率在4組超濾膜中比較理想，能夠滿足生產(chǎn)控制要求。因此，選用超濾膜PES10用于超濾濃縮工段。

2.5 固態(tài)腸溶木聚糖酶包衣材料選擇

酶作為飼料添加劑在飼料中得到大量使用。飼用腸溶酶相對顆粒酶在表面設(shè)計一層隔水膜，使其在飼料制粒的過程中可以免除高溫水蒸氣引起的酶失活，增加了酶的濕熱穩(wěn)定性。另一方面，這層隔水膜在強(qiáng)酸性環(huán)境中不會崩解，可以保證包含其內(nèi)的生物酶順利通過動物胃環(huán)境而不失活，最后到達(dá)偏中性的小腸定點(diǎn)釋放發(fā)揮作用。因而，固態(tài)腸溶木聚糖酶具有廣闊的市場前景，而生產(chǎn)固態(tài)腸溶木聚糖酶的關(guān)鍵在于包衣材料的選擇。分別選取腸溶性I、Ⅱ、Ⅲ號丙烯酸樹脂作薄膜包衣材料包衣后，將產(chǎn)品進(jìn)行高溫及釋放度測試，結(jié)果見表6。

由表6中可以看出，考慮到酶活和顆粒外觀的特性，選擇Ⅱ和Ⅲ號丙烯酸樹脂繼續(xù)進(jìn)行包衣優(yōu)化試驗(yàn)。將Ⅱ和Ⅲ號丙烯酸樹脂按照不同比例作薄膜包衣材料包衣后，將產(chǎn)品進(jìn)行高溫及釋放度測試，結(jié)果見表7。由表7可知，Ⅱ和Ⅲ號丙烯酸樹脂按照質(zhì)量比1∶1進(jìn)行包衣后，產(chǎn)品酶活達(dá)到了98.5%、顆粒外觀光澤性好、包衣過程中不易黏連，能夠滿足生產(chǎn)控制要求。

表5 不同孔徑超濾膜超濾測試結(jié)果Table 5 The test results of different aperture ultrafiltration membrane

表6 不同型號包衣材料測試結(jié)果Table 6 The test results of different types of coating material

表7 不同比例包衣材料測試結(jié)果Table 7 The test results of different propotion of coating material

2.6 木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.6.1 木聚糖酶最適條件研究 酶的酶學(xué)性質(zhì)對酶的工業(yè)化應(yīng)用具有重要的作用，酶的最適pH和最適反應(yīng)溫度是酶的重要性質(zhì)，本研究對木聚糖酶在不同pH和溫度下的酶活力進(jìn)行了測定，結(jié)果見圖3。由圖3(a)可看出，木聚糖酶活力隨著pH的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，pH為6.4時木聚糖酶活力達(dá)到最高。因此，確定木聚糖酶的最適pH為6.4。

由圖3(b)可知，該木聚糖酶的酶活在低于55 ℃下呈緩慢上升趨勢，當(dāng)溫度高于55 ℃后酶活急劇降低，溫度為55 ℃ 時酶活力最高。

2.6.2 木聚糖酶熱穩(wěn)定性研究 由圖4可看出，該木聚糖酶在40～50 ℃條件下4 h能100%保持活性，含水量17%的酶在90 ℃條件下2.5 min僅失活13.6%，該木聚糖酶具有較好的熱穩(wěn)定性。同干熱處理相比，濕熱處理對酶活的影響要大得多，與其他研究者[15-16]得出的結(jié)論一致。說明在相同溫度條件下濕熱環(huán)境更不利于木聚糖酶保持活力。

2.7 木聚糖酶降解產(chǎn)物的研究

用薄層色譜法測定了收集到的燕麥木聚糖降解產(chǎn)物S1、S2、S3和S4，結(jié)果見圖5。由圖5可知，降解產(chǎn)物S1中包含木糖和木二糖；降解產(chǎn)物S2中包含木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖；降解產(chǎn)物S3主要為葡萄糖；降解產(chǎn)物S4主要為阿拉伯糖。降解產(chǎn)物主要包括木二糖、木三糖、木四糖和木五糖，這4種糖占降解產(chǎn)物總量的90%以上，充分說明該木聚糖酶是一種內(nèi)切酶。

圖3 pH和溫度對酶活力的影響Figure 3 The effect of pH and temperature on the enzyme activity

圖4 酶的濕熱穩(wěn)定性和含水量為17%時在90 ℃的熱穩(wěn)定性Figure 4 The curve of hydrothermal stability of enzyme and the themal stability of the enzyme with 17% water content under 90 ℃

A.阿拉伯糖 G.葡萄糖 X1.木糖 X2.木二糖 X3.木三糖 X4.木四糖 X5.木五糖

圖5 酶對燕麥木聚糖的降解產(chǎn)物
Figure 5 The production from the degradation of oat spelt xylan by xylanase

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對大腸桿菌工程菌產(chǎn)木聚糖酶提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對獲得的木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。主要結(jié)論如下：

(1) 確定了木聚糖酶的提取工藝路線，在pH 2.5磷酸鹽緩沖液釋放度為5.0%，在pH 5.5磷酸鹽緩沖液釋放度為98.5%，產(chǎn)品外觀光澤性好，能夠很好地滿足市場對木聚糖酶的要求，因此該酶可以作為工業(yè)化產(chǎn)品投放市場。

(2) 酶學(xué)性質(zhì)研究表明該酶是一種以內(nèi)切作用為主的木聚糖酶，最適pH值為6.4，最適溫度為55 ℃，該酶具有較好的熱穩(wěn)定性，含水分量17%的酶在90 ℃條件下2.5 min僅失活13.6%。該木聚糖酶具有很好的酶學(xué)性質(zhì)。

(3) 目前木聚糖酶的生產(chǎn)和應(yīng)用具有很大的空間，下一步將考慮拓寬木聚糖酶在工業(yè)方面的應(yīng)用范圍。

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