吳永祥

吳麗萍1

王衛(wèi)東2

金泰完3

(1.黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041；2.黃山峰源生物科技有限公司，安徽 黃山 245600；3.安東國立大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，韓國 安東 760749)

皮膚光老化(Photoaging)是指由于皮膚長期暴露在外界有害因素(日曬、煙塵、化學(xué)物質(zhì)等)之下使得皮膚過早地出現(xiàn)衰老現(xiàn)象的一類疾病，其中紫外線是最為主要的誘因[1]。UV輻射會(huì)引起成纖維細(xì)胞生物學(xué)特征的改變，表現(xiàn)為皮膚粗糙、增厚、過多的色素沉著及出現(xiàn)深皺紋[2-3]。長期過量的UV輻射甚至?xí)鹌つw癌變，嚴(yán)重?fù)p害人體健康[4]。研究[5-6]表明，許多植物提取精華和中草藥中的化學(xué)物質(zhì)可有效防治皮膚光老化。

桑白皮是桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥根皮，為中國傳統(tǒng)常用中藥材，主產(chǎn)于安徽、四川、貴州、湖南等地。桑白皮多酚是桑白皮的次生代謝產(chǎn)物，主要包括Diels-Alder型加合物和黃酮類化合物等[7]。桑白皮多酚具有多種生物活性，包括抗氧化[8]、抗病毒[9]、鎮(zhèn)痛抗炎[10]、降血糖[11]及改善胰島素抵抗[12]等。本課題組前期研究[13]發(fā)現(xiàn)桑白皮多酚提取物具有抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶及3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的作用。雖然桑白皮多酚藥理作用的研究較多[10-13]，但關(guān)于桑白皮多酚對(duì)UV輻射致皮膚光老化修復(fù)作用的研究仍然缺乏。

本試驗(yàn)擬以桑白皮多酚為原料，首先研究CMP的抗氧化能力，在以成纖維HS68細(xì)胞為研究對(duì)象，探討CMP對(duì)UV輻射致成纖維細(xì)胞光老化的修復(fù)作用，并闡明其作用機(jī)制，為抗光老化功能性食品的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

桑白皮：安徽亳州藥材市場；

成纖維HS68細(xì)胞：美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection, ATCC)；

單寧酸(tannic acid, TA)、Folin-Ciocalteu試劑、BHA、ABTS、DPPH、MTT：分析純，美國Sigma公司；

PIP試劑盒：日本TaKaRa公司；

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液等：美國Gibco公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

全波長酶標(biāo)儀：SpectraMax-190型，美國Molecular Devices公司；

CO2恒溫培養(yǎng)箱：NU-8500型，美國Thermo公司；

超凈工作臺(tái)：DL-CJ-1N型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZF-75KB-III型，上海申安醫(yī)療器械廠；

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：ECOTM型，美國Illumina公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑白皮多酚提取物的制備 將桑白皮粉碎成粉末，按照料液比1∶10 (g/mL)與70%的乙醇溶液進(jìn)行混合，室溫條件下振蕩提取3次，每次4 h，過濾后收集上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至適量。取提取液加在處理好的大孔吸附樹脂柱上，用蒸餾水洗脫，再依次使用不同純度的乙醇沖洗，收集洗脫液，減壓濃縮回收溶劑，冷凍干燥得桑白皮多酚提取物。

1.2.2 多酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteu法[14-15]，以單寧酸作為標(biāo)準(zhǔn)品。繪制吸光值Y-質(zhì)量濃度X的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.001X-0.005，R2=0.999。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算桑白皮多酚的含量(mg TA/g)。

1.2.3 抗氧化活性的測定

(1) ABTS自由基清除能力：參考文獻(xiàn)[16]。

(2) DPPH自由基清除能力：參考文獻(xiàn)[17～18]。

1.2.4 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及細(xì)胞光老化模型的建立 成纖維HS68細(xì)胞置于(+)DMEM培養(yǎng)基(含100 U/mL 青鏈霉素、10%胎牛血清)，在37 ℃、5% CO2且相對(duì)飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的HS68細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL 接種于24孔板中，每孔500 μL。貼壁培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，并鋪上500 μL的PBS，置于紫外線燈下輻射。輻射條件：輻射劑量20 mJ/cm2，時(shí)間90 s，細(xì)胞距離光源20 cm[19]?？瞻讓?duì)照組不給予UV輻射。棄PBS，加入DMEM培養(yǎng)基(含100 U/mL 青鏈霉素、但不含10%胎牛血清)培養(yǎng)。

1.2.5 試驗(yàn)分組 將成纖維HS68細(xì)胞設(shè)置為空白對(duì)照組(無UV輻射及CMP處理)、UV模型組(給予UV輻射，無CMP處理)、CMP試驗(yàn)組(給予UV輻射及CMP處理)，各組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。CMP處理濃度為1，2，5 μg/mL。

1.2.6 細(xì)胞增殖活性的測定 接種于24孔板中的HS68細(xì)胞，給不同濃度CMP(1，2，5 μg/mL)處理48 h后，每孔加入50 μL的MTT染色液，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 h 后棄上清液，每孔加入500 μL二甲基亞砜溶液，室溫避光震蕩20 min，于570 nm波長處讀取OD值[20]。

1.2.7 PIP含量的測定 將接種于24孔板中的HS68細(xì)胞用不同濃度CMP(1，2，5 μg/mL)處理48 h后，收集細(xì)胞上清液，采用ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中PIP含量，操作方法參考PIP試劑盒說明書。

1.2.8 MMP-1、PIP mRNA表達(dá)水平的測定 取HS68細(xì)胞以1×105個(gè)/mL接種于60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，經(jīng)不同濃度CMP(1，2，5 μg/mL)處理48 h后，用Trizol法提取總RNA，按照PrimeScriptTMRT試劑盒合成cDNAs。加入SYBR Green、引物及cDNA模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)：MMP-1正義引物為5’-GGT GAT GAA GCA GCC CAG-3’，MMP-1反義引物為5’-CAG TAG AAT GGG AGA GTC-3’；PIP正義引物為5’-GAA CGC GTG TCA TCC CTT GT-3’，PIP反義引物為5’-GAA CGA GGT AGT CTT TCA GCA ACA-3’；β-actin正義引物為5’-GTT GGA CCT GAC AGA CTA CCT CA-3’，β-actin反義引物為5’-GTT GCC AAT AGT GAT GAC CT-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 桑白皮多酚對(duì)ABTS自由基的清除作用

由圖1可知，CMP具有顯著清除ABTS自由基的能力，且清除率隨著質(zhì)量濃度的增大先逐漸增強(qiáng)最后趨于恒定；BHA在1～10 μg/mL時(shí)，清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，且呈線性相關(guān)。CMP和BHA對(duì)ABTS自由基清除作用的IC50值分別為1.49，11.25 μg/mL，表明CMP對(duì)ABTS自由基清除能力顯著強(qiáng)于陽性對(duì)照BHA(P<0.05)。故桑白皮多酚具有顯著的ABTS自由基清除能力，而多酚類物質(zhì)是其主要的活性成分。

圖1 桑白皮多酚對(duì)ABTS自由基的清除作用Figure 1 ABTS free radical scavenging ability of polyphenol from Cortex Mori

2.2 桑白皮多酚對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖2表明，在1～10 μg/mL時(shí)，CMP和BHA對(duì)DPPH自由基清除能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，呈明顯的濃度依賴性，且差異顯著(P<0.05)。CMP和BHA清除DPPH自由基的IC50值分別為8.94，11.03 μg/mL，說明桑白皮多酚對(duì)DPPH自由基清除能力大于人工合成抗氧化劑BHA。以上結(jié)果顯示，桑白皮多酚對(duì)DPPH和ABTS自由基清除能力的變化規(guī)律具有較好的一致性，說明多酚類物質(zhì)是桑白皮的主要抗氧化活性成分。

圖2 桑白皮多酚對(duì)DPPH自由基的清除作用Figure 2 DPPH free radical scavenging ability of polyphenol from Cortex Mori

2.3 桑白皮多酚對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響

由圖3可知，成纖維HS68細(xì)胞經(jīng)UV輻射后，細(xì)胞存活率明顯降低，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異(P<0.05)，表明體外HS68細(xì)胞光老化模型建立成功。與UV模型組[(60.90±0.46)%]相比，不同濃度CMP(1，2，5 μg/mL)作用48 h后，其細(xì)胞存活率分別為(64.78±1.84)%，(70.89±2.20)%，(75.76±0.68)%，呈劑量依賴性增加，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明桑白皮多酚能提高光老化成纖維細(xì)胞的增殖活性，對(duì)細(xì)胞損傷具有一定的修復(fù)作用。后續(xù)試驗(yàn)細(xì)胞PIP分泌水平及MMP-1、PIP的mRNA表達(dá)的測定均采用此濃度的添加量進(jìn)行研究。

不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05圖3 桑白皮多酚對(duì)細(xì)胞增殖作用的影響Figure 3 Effect of polyphenol from Cortex Mori on cell proliferation

2.4 桑白皮多酚對(duì)細(xì)胞PIP含量的影響

由圖4可知，PIP標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(Y)與OD值(X)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=47.12X2+106.4X-1.914(R2=0.999)，說明方程擬合有效。由圖5可知，成纖維HS68細(xì)胞經(jīng)過UV輻射后，其PIP的含量發(fā)生了變化。與空白對(duì)照組[(624.09±10.93) ng/mL]相比，UV模型組PIP含量明顯降低，達(dá)到了(497.58±17.38) ng/mL，存在著顯著性差異(P<0.05)。與UV模型組相比，CMP可以顯著提高UV輻射后細(xì)胞中的PIP含量，隨著CMP濃度的增加，PIP含量呈濃度依賴性提高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。PIP含量的降低，可導(dǎo)致皮膚中膠原蛋白合成的減少，從而出現(xiàn)皺縮細(xì)紋等衰老癥狀[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，桑白皮多酚增加了UV輻射后成纖維細(xì)胞中PIP的含量，具有潛在的抗光老化作用。

圖4 PIP標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 4 Standard curve of PIP

不同小寫字母表示差異顯著，P<0.05圖5 桑白皮多酚對(duì)細(xì)胞PIP含量的影響Figure 5 Effect of polyphenol from Cortex Mori on PIP content

2.5 桑白皮多酚對(duì)細(xì)胞MMP-1、PIP mRNA表達(dá)的影響

由表1可知，與空白對(duì)照組相比，UV模型組在給予UV輻射后，細(xì)胞中MMP-1的mRNA表達(dá)水平顯著升高，PIP的mRNA 表達(dá)水平顯著降低?？瞻讓?duì)照組中MMP-1、PIP的mRNA表達(dá)水平分別為(0.08±0.00)，(1.00±0.00)，而UV模型組分別為(1.00±0.00)，(0.33±0.01)，兩者存在著顯著性差異(P<0.05)。與UV模型組相比，CMP能夠顯著下調(diào)UV輻射損傷細(xì)胞內(nèi)MMP-1的mRNA表達(dá)量，提高PIP的mRNA水平，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。研究[22]證明，MMP-1過度表達(dá)時(shí)，將會(huì)抑制PIP的正常表達(dá)，破壞皮膚膠原纖維和彈性纖維的正常結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致皮膚光老化。結(jié)果表明，桑白皮多酚通過調(diào)控MMP-1和PIP的mRNA表達(dá)，起到光老化修復(fù)作用。

表1桑白皮多酚對(duì)細(xì)胞MMP-1、PIP mRNA表達(dá)的影響?
Table 1 Effect of polyphenol fromCortexMorion MMP-1, PIP mRNA expressions

組別濃度/(μg·mL-1)MMP?1/β?actin比值PIP/β?actin比值空白對(duì)照組-0．08±0．00d1．00±0．00aUV-1．00±0．00a0．33±0．01dCMP11．03±0．04a0．35±0．03cd20．91±0．02b0．39±0．01bc50．84±0．02c0．42±0．02b

? 同列不同上標(biāo)字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

本研究揭示了桑白皮多酚能有效抵抗UV誘導(dǎo)的皮膚光老化，其作用機(jī)制可能與有效清除自由基，抑制細(xì)胞內(nèi)MMP-1表達(dá)及調(diào)控PIP合成有關(guān)。下一步將對(duì)桑白皮多酚做進(jìn)一步的分離純化，以明確桑白皮多酚抗皮膚光老化的主要活性成分。

[1] 高擎, 金鑫, 葛亞中, 等.組方提取物A的抗光化功效及其機(jī)理研究[J].現(xiàn)代食品科技, 2016, 32(8): 100-106.

[2] CHOI J W, LEE J, PARK Y I.7,8-Dihydroxyflavone attenu-ates TNF-α-induced skin aging in Hs68 human dermal fibroblast cells via down-regulation of the MAPKs/Akt signaling pathways[J].Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017, 95: 1 580-1 587.

[3] 殷花, 林忠寧, 朱偉.皮膚光老化發(fā)生機(jī)制及預(yù)防[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué), 2014, 31(7): 565-569.

[4] 樊迎, 王常青, 王菲, 等.黑豆乳清多肽抗皮膚光老化作用的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2013, 25(4): 539-543.

[5] 路婷婷, 陳亞澤, 盧濤, 等.紫外線的皮膚損傷機(jī)制及具有紫外線防護(hù)作用的天然產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào), 2012, 28(12): 1 655-1 659.

[6] HA S J, LEE J, KIM H, et al.Preventive effect ofRhusjavanicaextract on UVB-induced skin inflammation and photoaging [J].Journal of Functional Food, 2016, 27: 589-599.

[7] 李墨靈, 張晗, 夏慶梅.桑白皮的化學(xué)、藥理與藥代動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展[J].西部中醫(yī)藥, 2017, 30(2): 137-139.

[8] DAI Sheng-jun, WU Yan, WANG Ying-hong, et al.New diels-alder type adducts fromMorusmacrouraand their antioxidant activities[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2004, 52(10): 1 190-1 193.

[9] DU Jiang, HE Zhen-dan, JIANG Ren-wang, et al.Antiviral flavonoids from the root bark ofMorusalbaL.[J].Phytochemis-try, 2003, 62(8): 1 235-1 238.

[10] 俸婷婷, 謝體波, 林冰, 等.桑白皮總黃酮的鎮(zhèn)痛抗炎藥理作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2013, 24(11): 2 580-2 582.

[11] ZHANG Mi, CHEN Man, ZHANG Han-qing, et al.Invivohypoglycemic effects of phenolics from the root bark ofMorusalba[J].Fitoterapia, 2009, 80(8): 475-477.

[12] 高穎, 高英, 李艷, 等.桑白皮黃酮提取物對(duì)2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 33(6): 831-835.

[13] WU Yong-xiang, KIM Y J, LI Sha, et al.Anti-obese effects of mulberry (MorusalbaL.) root bark through the inhibition of digestive enzymes and 3T3-L1 adipocyte differentiation[J].The Korean Society of Food Preservation, 2015, 22(1): 27-35.

[14] 吳永祥, 王祥, 江海濤, 等.不同極性柳葉蠟梅葉萃取物總酚含量及其抗氧化、抑菌能力研究[J].食品與機(jī)械, 2017, 33(8): 150-154.

[15] 宋麗軍, 候旭杰, 李雅雯, 等.核桃青皮中多酚的超高壓提取工藝優(yōu)化[J].食品與機(jī)械, 2015, 31(4): 178-182.

[16] 嚴(yán)鑫, 王委, 劉量.綬草萃取物體外抗氧化活性及其總酚含量比較[J].食品與機(jī)械, 2016, 32(8): 143-146.

[17] 吳德智, 鄭強(qiáng), 李安, 等.纈草總黃酮超聲輔助雙水相提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[J].食品與機(jī)械, 2017, 33(5): 162-167.

[18] 吳永祥, 楊慶, 李林, 等.豆腐柴葉揮發(fā)油化學(xué)成分及其抗氧化和抑菌作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2018, 30(1): 45-51.

[19] HUANG Chung-yu, LIN Yi-tzu, KUO Hsiang-chun, et al.Compounds isolated fromEriobotryadeflexaleaves protect against ultraviolet radiation B-induced photoaging in human fibroblasts[J].Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology, 2017, 175: 244-253.

[20] EBADI P, FAZELI M.Anti-photoaging potential of propolis extract in UVB-irradiated human dermal fibroblasts through increasing the expression of FOXO3A and NGF genes[J].Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017, 95: 47-54.

[21] LEE J J, KIM K B, HEO J, et al.Protective effect ofArthrospiraplatensisextracts against ultraviolet B induced cellular senescence through inhibition of DNA damage and matrix metalloproteinase-1 expression in human dermal fibroblasts[J].Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology, 2017, 173: 196-203.

[22] 劉大旭, 高曉波, 祁永華, 等.杜仲有效成分β-萘黃酮對(duì)UVB誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞光老化保護(hù)作用研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào), 2016, 44(3): 41-43.