高丹丹

馬忠仁

熱孜萬(wàn)古力·賽買(mǎi)提

田曉靜

李明生

陳士恩

(西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

Plastein反應(yīng)又稱(chēng)類(lèi)蛋白反應(yīng)或塑蛋白反應(yīng)，是指在一定條件下，蛋白酶催化高濃度的蛋白質(zhì)水解物或低聚肽的混合物，生成沉淀、觸變膠體或具觸變性黏稠的膠狀類(lèi)蛋白產(chǎn)物的過(guò)程[1]。一般認(rèn)為Plastein反應(yīng)是蛋白酶存在下蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的逆反應(yīng)，分為水解、濃縮和合成三步[2]。該反應(yīng)的機(jī)理較為復(fù)雜，可能涉及水解反應(yīng)、濃縮作用、轉(zhuǎn)肽作用、物理聚集中的一種或幾種[3]。Plastein反應(yīng)能夠產(chǎn)生原料蛋白質(zhì)所沒(méi)有的新肽段，其產(chǎn)物具有與原料蛋白質(zhì)不同的氨基酸序列，可以去除蛋白質(zhì)水解物的苦味，改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，已成為食品工業(yè)研究的熱點(diǎn)[4]。

目前采用Plastein反應(yīng)修飾生物活性肽的研究較多，諸如：吳丹等[5]曾對(duì)酪蛋白進(jìn)行酶水解及Plastein修飾改善其抗氧化性；楊鋒等[6]曾對(duì)醋蛋水解物進(jìn)行類(lèi)蛋白修飾,并初步研究了產(chǎn)物的抗氧化活性；張強(qiáng)等[7]研究發(fā)現(xiàn)雙孢蘑菇源抗氧化肽修飾產(chǎn)物的抗氧化活性大概是修飾前的4倍；王晗欣等[8]研究發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆蛋白抗氧化肽修飾產(chǎn)物的還原力和羥自由基清除率都有顯著提高；汪敬科等[9]采用Plastein反應(yīng)在堿性蛋白酶存在條件下對(duì)酪蛋白水解物進(jìn)行修飾，制備多個(gè)不同修飾程度的Plastein反應(yīng)產(chǎn)物，修飾后其ACE抑制活性逐漸增加(增加至49%～62%)。上述研究表明，Plastein反應(yīng)修飾可以顯著提高某些生物活性肽的功效。但Plastein反應(yīng)用于改善馬鈴薯蛋白源ACE抑制肽活性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬以馬鈴薯蛋白為原料，在前期研究[10-11]的基礎(chǔ)上，采用胰蛋白酶水解馬鈴薯蛋白制備ACE抑制肽，對(duì)馬鈴薯蛋白ACE抑制肽進(jìn)行Plastein反應(yīng)修飾，并對(duì)修飾的工藝條件進(jìn)行研究，以期提高馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的活性，為天然高效ACE抑制劑的制備提供一種新途徑，為馬鈴薯蛋白資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

馬鈴薯：隴薯10號(hào)，購(gòu)自蘭州市物美大賣(mài)場(chǎng)；

馬鈴薯蛋白ACE抑制肽：ACE抑制率為(61.20±0.15)%，實(shí)驗(yàn)室自制。

胰蛋白酶：10 000 U/mg，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

ACE：2.0 U/mg，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)：分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

十二烷基磺酸鈉：分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

鄰苯二甲醛：分析純，北京索萊寶生物試劑；

甘氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-酪氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴(lài)氨酸、亮氨酸：分析純，上海中秦化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：UV-2000型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：TGL-16型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；

恒溫磁力攪拌器：MYP11-2A型，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；

鼓風(fēng)干燥箱： DHG-9030型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

電子天平：FA2004B 型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：Megafuge 8R型，美國(guó)熱電照生有限公司；

數(shù)顯酸度計(jì)：PHS-3C型，杭州雷磁分析儀器廠；

超低溫冰箱：DW-86L490J型，青島海爾特種電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯蛋白質(zhì)的提取 馬鈴薯洗凈削皮切丁，用一定量的0.09% NaCl溶液和0.12%的亞硫酸鈉混合液在室溫下浸提1 h左右，馬鈴薯與提取液的比值為1∶10 (g/mL)，-4 ℃，3 000 r/min離心15 min，取上清液，加入1 mol/L HCl溶液調(diào)pH 4.2左右，于磁力攪拌器上攪拌10 min，靜止1 h，再于-4 ℃，3 000 r/min離心15 min，保留沉淀，置于冷凍干燥機(jī)中凍干，得到馬鈴薯蛋白粉[10]。

1.2.2 馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的制備工藝

馬鈴薯蛋白懸濁液→調(diào)pH→加酶→調(diào)水浴溫度37 ℃→滅酶(90 ℃水浴15 min)→離心(10 000 r/min，20 min)→取上清液→冷凍干燥[11]

1.2.3 ACE抑制率測(cè)定 將ACE底物HHL溶解于0.1 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH值8.3，含0.2 mol/L NaCl)中配制成6 mmol/L的濃度。取100 μL的HHL與100 μL的ACE抑制劑混合，然后加入150 μL 5 U/mL的ACE溶液，37 ℃ 反應(yīng)60 min。加入250 μL的HCl(1 mol/L)終止反應(yīng)，再加入1.5 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，強(qiáng)烈震蕩1 min，3 000 r/min 離心5 min。取酯層部分0.5 mL，在110 ℃下蒸干。繼續(xù)加入3 mL氯化鈉溶液(1 mol/L)溶解殘?jiān)?，? mol/L 氯化鈉溶液作參比，在228 nm下測(cè)定其吸光值記做S，用蒸餾水代替酶解肽，步驟同上，測(cè)定其吸光值記做A，用蒸餾水代替粗酶液和酶解肽液，測(cè)定其吸光值記做C[12]。按式(1)計(jì)算ACE抑制率：

(1)

式中：

N——ACE抑制率，%；

A——在反應(yīng)中不加抑制劑的吸光值；

S——在反應(yīng)中同時(shí)加入ACE和ACE抑制劑的吸光值；

C——ACE與HHL空白反應(yīng)的吸光值。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 以Plastein反應(yīng)產(chǎn)物ACE抑制率為指標(biāo)，分別研究外源氨基酸的種類(lèi)、酶與底物濃度比([E]/[S])、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH、反應(yīng)時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響。

(1) 外源氨基酸的種類(lèi)：稱(chēng)取15 g的馬鈴薯蛋白ACE抑制肽于試劑瓶中，加50 mL蒸餾水配制成底物濃度為30%的懸浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例分別加入甘氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸，調(diào)節(jié)pH值為8.0，反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間2 h，[E]/[S] 3 000 U/g，95 ℃滅酶10 min，10 000 r/min 離心5 min，取上清液，測(cè)定Plastein反應(yīng)產(chǎn)物ACE抑制率。

(2) [E]/[S]：稱(chēng)取15 g的馬鈴薯蛋白ACE抑制肽于試劑瓶中，加50 mL蒸餾水配制成底物濃度為30%的懸浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例加入甘氨酸，調(diào)節(jié)pH值為8.0，反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間2 h，分別控制[E]/[S]為 2 500，3 000，3 500，4 000，4 500 U/g，95 ℃滅酶10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液，測(cè)定Plastein反應(yīng)產(chǎn)物ACE抑制率。

(3) 反應(yīng)溫度：稱(chēng)取15 g的馬鈴薯蛋白ACE抑制肽于試劑瓶中，加50 mL蒸餾水配制成底物濃度為30%的懸浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例加入甘氨酸，調(diào)節(jié)pH值為8.0，分別控制反應(yīng)溫度為32，37，42，47，52 ℃，反應(yīng)時(shí)間2 h，[E]/[S] 3 500 U/g，95 ℃滅酶10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液，測(cè)定Plastein反應(yīng)產(chǎn)物ACE抑制率。

(4) 反應(yīng)pH：稱(chēng)取15 g的馬鈴薯蛋白ACE抑制肽于試劑瓶中，加50 mL蒸餾水配制成底物濃度為30%的懸浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例加入甘氨酸，分別控制pH值為7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，反應(yīng)溫度42 ℃，反應(yīng)時(shí)間2 h，[E]/[S] 3 500 U/g，95 ℃滅酶10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液，測(cè)定Plastein反應(yīng)產(chǎn)物ACE抑制率。

(5) 反應(yīng)時(shí)間：稱(chēng)取15 g的馬鈴薯蛋白ACE抑制肽于試劑瓶中，加50 mL蒸餾水配制成底物濃度為30%的懸浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例加入甘氨酸，調(diào)節(jié)pH值為8.0，反應(yīng)溫度42 ℃，分別控制反應(yīng)時(shí)間為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h，[E]/[S] 3 500 U/g，95 ℃滅酶10 min，10 000 r/min 離心5 min，取上清液，測(cè)定Plastein反應(yīng)產(chǎn)物ACE抑制率。

1.2.5 響應(yīng)面分析 在單因素的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的抑制率為響應(yīng)值，選擇反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH、[E]/[S]進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化Plastein反應(yīng)修飾的工藝條件。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用F檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析來(lái)評(píng)價(jià)響應(yīng)面回歸模型的統(tǒng)計(jì)意義，采用Design-Expert V 8.0.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素分析

2.1.1 外源氨基酸種類(lèi)對(duì)馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應(yīng)的影響 由圖1可知，加入8種外源氨基酸之后，馬鈴薯蛋白ACE抑制肽修飾產(chǎn)物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶均表現(xiàn)出一定的抑制活性。加入甘氨酸后，修飾產(chǎn)物的ACE抑制率最高達(dá)到了(75.1±2.12)%，L-苯丙氨酸加入后ACE抑制率最低，為(49.1±0.82)%。添加亮氨酸、L-酪氨酸、L-賴(lài)氨酸、L-組氨酸、L-纈氨酸和L-甲硫氨酸后的ACE抑制率依次為(73.70±1.24)%，(71.10±1.43)%，(67.90±0.11)%，(62.20±1.05)%，(59.30±1.04)%，(53.20±0.98)%。表明甘氨酸對(duì)馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的Plastein反應(yīng)修飾效果最好，故選用甘氨酸為最佳外源氨基酸。

圖1 外源氨基酸種類(lèi)對(duì)馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的Plastein反應(yīng)的影響Figure 1 The effect of extrinsic amino acid on ACE inhibitory activity

2.1.2 [E]/[S]對(duì)馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應(yīng)的影響 由圖2可知，隨著[E]/[S]的增加，抑制率隨之增大，但增加到3 500 U/g時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最大值[(79.30±0.95)%]，繼續(xù)增加加酶量，抑制率減小。隨著[E]/[S]的增大，Plastein反應(yīng)修飾程度達(dá)到最大，但此時(shí)修飾產(chǎn)物的ACE抑制率降低，可能是[E]/[S]過(guò)大，過(guò)多的蛋白酶容易催化修飾產(chǎn)物重新發(fā)生水解反應(yīng)，促使體系中活性物質(zhì)減少，進(jìn)而導(dǎo)致其ACE抑制率降低[13]。故選擇3 500 U/g 作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖2 酶與底物濃度比對(duì)ACE抑制率的影響Figure 2 The effect of Enzyme/Substrate ratio on ACE inhibitory activity

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應(yīng)的影響 由圖3可知，ACE的抑制率會(huì)隨著溫度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為42 ℃時(shí)，ACE抑制率達(dá)到最大值[(78.95±0.42)%]。溫度對(duì)ACE抑制肽抑制率的影響主要是通過(guò)影響酶的活性實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)溫度低于42 ℃時(shí)，隨著酶解溫度的增大，酶促反應(yīng)速度加快，ACE抑制率也逐步增大，而當(dāng)溫度超過(guò)42 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶可能失活而導(dǎo)致抑制率下降[14]。故選擇42 ℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)ACE抑制率的影響Figure 3 The effect of reaction temperature on ACE inhibitory activity

2.1.4 反應(yīng)pH值對(duì)馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應(yīng)的影響 由圖4可知，隨著pH值的增大，馬鈴薯蛋白ACE抑制肽修飾產(chǎn)物的ACE抑制率先增大后減小，pH 8.0時(shí)，修飾產(chǎn)物的ACE抑制率最高，達(dá)到(79.20±0.65)%。低于或高于此pH值，修飾產(chǎn)物的ACE抑制能力均有不同程度的減弱，可能是偏酸性或偏堿性環(huán)境會(huì)引起蛋白酶和底物蛋白發(fā)生一定程度的變性，從而使蛋白酶失去部分催化功能，底物蛋白喪失部分生物活性，進(jìn)而減弱修飾產(chǎn)物的ACE抑制能力[15]。故選擇8.0作為最佳反應(yīng)pH值。

圖4 反應(yīng)pH值對(duì)ACE抑制率的影響Figure 4 The effect of reaction pH on ACE inhibitory activity

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應(yīng)的影響 由圖5可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，馬鈴薯蛋白ACE抑制肽修飾產(chǎn)物的ACE抑制率隨之上升，但是當(dāng)時(shí)間達(dá)到3.0 h時(shí)ACE抑制率達(dá)到最大值[(79.7±1.22)%]，反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，ACE抑制率下降。這可能是反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，修飾產(chǎn)物在蛋白酶的作用下又發(fā)生了水解反應(yīng)，重新生成了分子質(zhì)量相對(duì)較小的肽類(lèi)物質(zhì)，修飾程度降低[16]。故選擇3.0 h 作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響Figure 5 The effect of reaction time on ACE inhibitory activity

2.2 馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應(yīng)修飾響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 見(jiàn)表1。

2.2.2 多元二次模型方程的建立與檢驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析得到多元二次關(guān)系式：

Y=82.84+0.28A+0.27B+0.21C+0.14AB-0.14AC-0.15BC-0.43A2-1.40B2-0.98C2。

(2)

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Designs of Response surface experiment

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
Table 2 The design and experiment results of Box-Behnken Response surface test

序號(hào)ABCACE抑制率/%試驗(yàn)值預(yù)測(cè)值10．00-1．001．0080．89±0．1580．5620．000．000．0083．05±0．0582．843-1．001．000．0081．12±0．0280．8641．00-1．000．0080．63±0．0580．8950．001．001．0080．79±0．2180．7861．001．000．0081．76±0．1681．707-1．00-1．000．0080．55±0．1380．618-1．000．00-1．0080．87±0．0980．8191．000．00-1．0081．93±0．1481．66100．000．000．0082．54±0．0582．8411-1．000．001．0081．24±0．0881．51120．00-1．00-1．0079．83±0．0479．84130．000．000．0082．94±0．0982．84141．000．001．0081．72±0．2381．79150．001．00-1．0080．35±0．3480．68160．000．000．0082．86±0．1582．84170．000．000．0082．83±0．1382．84

表3 二次多項(xiàng)模型方差分析結(jié)果?Table 3 The variance analysis results of two multinomial models

2.2.3 響應(yīng)面分析和優(yōu)化 由圖6可知，反應(yīng)溫度與反應(yīng)pH值、反應(yīng)溫度與[E]/[S]以及pH值和[E]/[S]的交互作用對(duì)修飾產(chǎn)物的ACE抑制率無(wú)顯著影響。當(dāng)[E]/[S]固定在0水平時(shí)，隨著反應(yīng)pH值的升高，修飾產(chǎn)物的ACE抑制能力呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)；隨著反應(yīng)溫度的升高，修飾產(chǎn)物的ACE抑制能力逐漸增大。當(dāng)pH值固定在0水平時(shí)，隨著[E]/[S]的升高，修飾產(chǎn)物的ACE抑制能力呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)；隨著反應(yīng)溫度的升高，修飾產(chǎn)物的ACE抑制能力逐漸增大。當(dāng)溫度固定在0水平時(shí)，隨著[E]/[S]的升高，修飾產(chǎn)物的ACE抑制能力呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，可能是由于過(guò)量的蛋白酶會(huì)引發(fā)修飾產(chǎn)物發(fā)生二次水解，使體系中抗氧化活性物質(zhì)的數(shù)量有所減少，從而影響修飾產(chǎn)物的ACE抑制能力；隨著反應(yīng)pH值的升高，修飾產(chǎn)物的ACE抑制能力也呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。

圖6 交互作用影響抑制率的曲面圖及等高線圖Figure 6 Surface chart and contour map of the interaction affect the ACE inhibitory activity

2.2.4 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)的17組試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert V 8.0.6 軟件獲得了ACE抑制率最高時(shí)各個(gè)因素的最佳反應(yīng)條件為：溫度43.68 ℃、反應(yīng)pH 8.05、反應(yīng)時(shí)間3.0 h，[E]/[S] 3 565.05 U/g，在此反應(yīng)條件下，經(jīng)由Plastein反應(yīng)修飾的馬鈴薯蛋白ACE抑制肽對(duì)ACF的理論抑制率為(82.913±0.958)%。

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和精確性，在最適反應(yīng)條件下進(jìn)行修飾反應(yīng)并測(cè)定產(chǎn)物的ACE抑制率，3組平行實(shí)驗(yàn)所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為82.86%，82.95%，82.85%，平均值為(82.89±0.05)%，由此可見(jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際反應(yīng)情況。

3 結(jié)論

采用胰蛋白酶水解馬鈴薯蛋白制備ACE抑制肽(ACE抑制率為61.20%±0.15%)，以ACE抑制能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化了馬鈴薯蛋白ACE抑制肽Plastein反應(yīng)修飾工藝，得最佳工藝為：以甘氨酸為處源氨基酸，溫度43.68 ℃、反應(yīng)體系pH 8.05、反應(yīng)時(shí)間3.0 h、[E]/[S] 3 565.05 U/g，底物濃度30%、外源氨基酸比例0.5 mmol/g·多肽，在最優(yōu)反應(yīng)條件下，抑制率可以達(dá)到(82.89±0.05)%。本研究通過(guò)Plastein反應(yīng)修飾的方法有效提高了馬鈴薯蛋白ACE抑制肽的降血壓活性，為其作為天然高效降血壓劑方面的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)，并為馬鈴薯資源的綜合利用提供新途徑。

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