吳林果 劉 丹 武 燁 馬新亮 劉慧榮

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 北京 100069； 2.代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069; 3.首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院，北京 101300)

衰老是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一，心血管疾病的發(fā)病率隨年齡的增高而增加[1]。因此了解心臟衰老的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，對(duì)降低老齡化導(dǎo)致的心血管疾病的發(fā)病率具有重要意義。

線粒體被認(rèn)為是介導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老的關(guān)鍵細(xì)胞器[2-3]。心肌細(xì)胞中含有豐富的線粒體，在細(xì)胞的功能維持方面起著關(guān)鍵的作用。線粒體通過形態(tài)及功能的改變[4]來進(jìn)行自身的自我更新，有研究[5]表明，線粒體形態(tài)及功能的改變?cè)谛难芗膊≈邪l(fā)揮著重要作用，但在衰老心臟中發(fā)揮的作用并不清楚。

熱休克因子(heat shock factor 1,HSF1)是熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，在熱應(yīng)激或者某些損傷刺激條件下可調(diào)控?zé)嵝菘说鞍椎谋磉_(dá)，以提高機(jī)體在不良環(huán)境下的防御能力[6]。在衰老的大鼠骨骼肌中HSF1的表達(dá)增多[7]，同時(shí)也有研究[8]顯示在線粒體損傷之后可激活HSF1，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲。衰老伴隨著線粒體發(fā)生損傷，但在衰老的心肌中HSF1的表達(dá)是否發(fā)生變化，及與線粒體損傷之間是否存在一定的關(guān)系并不清楚，因此在本實(shí)驗(yàn)中通過檢測衰老心肌中HSF1表達(dá)的變化，觀察衰老心肌中線粒體的形態(tài)及功能方面的改變，來明確衰老心肌中HSF1與損傷的線粒體功能之間的關(guān)系，為揭示心肌衰老的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及衰老相關(guān)心血管疾病的治療提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

根據(jù)小鼠和人的生命周期對(duì)比，年輕組(young)使用4月齡，老年組(aging)組使用24月齡SPF級(jí)成年雄性C57小鼠(C57BL/6)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由愛爾麥特科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2014-007。本實(shí)驗(yàn)獲得了首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)的批準(zhǔn)，并嚴(yán)格遵守首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理細(xì)則。

1.2 主要試劑與材料

H9C2心肌細(xì)胞系，購于協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。Anti-HSF1(#4356，美國CST公司)、 GAPDH抗體(#2118，美國CST公司)、 30%(體積分?jǐn)?shù))H2O2(KGF009，南京凱基生物)、山羊抗兔IgG/生物素標(biāo)記(ZB-2301，北京中杉金橋公司)、山羊抗小鼠IgG/生物素標(biāo)記(ZB-2305，北京中杉金橋公司)、戊二醛(50%體積分?jǐn)?shù))(G7651，美國Sigma公司)、胎牛血清(FNA500，上海依科賽生物公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基(10817014,美國Corning公司)、線粒體膜電位檢測試劑盒(C2006，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、ATP 含量測定試劑盒(A095-2，南京建成生物工程研究所)、增強(qiáng)型ATP 檢測試劑盒(S0027,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)測定試劑盒(化學(xué)熒光法)(E004，南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)； Western blotting電泳儀、Western blotting電轉(zhuǎn)儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；JEM-1400EX透射電子顯微鏡(日本電子公司)、激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.4 透射電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)的改變

小鼠眼球取血處死后，快速剪取新鮮心臟的心尖部，在預(yù)冷的2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛中切割成0.5～1.0 mm3，4℃固定2～4 h,1%(體積分?jǐn)?shù))PB溶液洗3次，每次10 min，所有操作均在冰上進(jìn)行。處理好的組織送電鏡室進(jìn)行標(biāo)本制備，所有操作均在冰上進(jìn)行，用透射電子顯微鏡觀察心肌線粒體的結(jié)構(gòu)改變。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥

用含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)傳代至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)6孔板中細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)，給予200 μmol/L H2O2刺激4 h,之后更換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.6 心肌組織及細(xì)胞中ROS的檢測

1.6.1 組織ROS檢測

稱取小鼠心肌組織，按1 g組織20 mL的比例加入緩沖液進(jìn)行勻漿，1 000×g 離心10 min，取上清液，BCA法測濃度后加入1 mmol/L 2′,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA) 的熒光探針，用酶標(biāo)儀測其熒光強(qiáng)度。

1.6.2 細(xì)胞ROS檢測

在H2O2刺激后的H9C2心肌細(xì)胞中將 DCFH-DA探針加入培養(yǎng)基中，使其濃度達(dá)到10 μmol/L, 37 ℃孵育1 h,之后用PBS洗2次，加入0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶消化，終止消化后 1 000×g 離心10 min收集細(xì)胞，PBS洗2次后進(jìn)行熒光檢測。

1.7 心肌組織及細(xì)胞中ATP檢測

1.7.1 心肌組織中ATP的檢測

準(zhǔn)確稱取小鼠的心肌組織，按照1 g組織9 mL沸水的比例加入沸雙蒸水，使其變成10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))勻漿液，并置于沸水中水浴10 min，之后混勻，3 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行檢測。

1.7.2 細(xì)胞中ATP含量的檢測

吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，按照6孔板每孔加入200 μL裂解液裂解細(xì)胞。收集裂解液4℃ 12 000×g離心5 min，取上清，按照試劑盒操作說明配制ATP工作液和標(biāo)準(zhǔn)品，然后進(jìn)行熒光檢測。

1.8 Western blotting法檢測心肌組織中相關(guān)蛋白表達(dá)

剪取適量的心肌組織，按照1 mg組織∶10 μL裂解液比例加入RIPA裂解液，提取心肌組織蛋白，BCA法測蛋白濃度，取30～50 μg的蛋白加入上樣緩沖液, 99 ℃變性8 min，SDS-PAGE凝膠電泳后采取濕轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件：400 mA，1 h。5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉室溫封閉1 h，之后加入一抗4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h, TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

1.9 JC-1 檢測H9C2 心肌細(xì)胞線粒體膜電勢

將細(xì)胞種至3.5cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用H2O2刺激4 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗1次，加入1 mL完全培養(yǎng)基,之后在培養(yǎng)基中加入1 mL JC-1染色工作液混勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min,在孵育期間，冰上配制1×JC-1染色緩沖液。37 ℃孵育結(jié)束后，棄上清，用1×JC-1染色緩沖液洗滌2次，之后加入2 mL高糖 DMEM 完全培養(yǎng)基在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 衰老小鼠心肌中線粒體形態(tài)及功能異常

利用透射電鏡對(duì)年輕小鼠和衰老小鼠心肌的線粒體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，與年輕組小鼠心肌的線粒體(圖1A)相比，衰老小鼠心肌的線粒體輪廓模糊，線粒體膜不完整，線粒體嵴排列紊亂(圖1B)，在衰老心肌中，心肌細(xì)胞中的線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常。與4月齡的年輕小鼠相比，衰老小鼠心肌組織中ATP的含量降低(1.253±0.059vs0.479±0.122,P=0.012,圖1C)，而ROS的含量升高(0.853±0.096vs1.550±0.233，P=0.025，圖1D)，衰老的心肌中線粒體的氧化磷酸化功能出現(xiàn)異常。

圖1 衰老心肌中線粒體的結(jié)構(gòu)及功能的改變Fig.1 Mitochondrial dysfunction in aging myocardium

2.2 衰老小鼠心肌中HSF1表達(dá)增高

與年輕組小鼠相比，衰老小鼠心肌組織中HSF1的表達(dá)明顯升高(0.980±0.112vs1.979±0.175，P=0.013)(圖2)。

2.3 衰老心肌中HSF1的表達(dá)與ATP含量相關(guān)性

對(duì)HSF1的蛋白水平與ATP及ROS含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，衰老小鼠鼠心肌組織中HSF1的蛋白水平與ATP的含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.977,P=0.005)，與ROS的含量呈正相關(guān)(r=0.934,P=0.020)。衰老心肌組織中表達(dá)增加的HSF1與線粒體的功能呈負(fù)相關(guān)(圖3)。

圖2 衰老心肌組織中HSF1的表達(dá)Fig.2 Expression of HSF1 in the myocardium

圖3 衰老小鼠心肌組織中HSF1的表達(dá)與ATP及ROS的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between the expression of HSF1 and the function of the mitochondria in aging heart

2.4 H2O2 刺激心肌細(xì)胞后線粒體發(fā)生損傷

在H2O2刺激后，H9C2心肌細(xì)胞的膜電位下降(圖4A)，同時(shí)檢測細(xì)胞中ATP及ROS含量的變化進(jìn)一步觀察細(xì)胞線粒體的功能是否發(fā)生損傷，H2O2刺激H9C2細(xì)胞中ATP含量下降(1.012±0.071vs0.643±0.095,P=0.007)(圖4B)，ROS含量上升(1.035±0.046vs1.803±0.28,P=0.020)(圖4C)。H2O2刺激后線粒體發(fā)生了損傷。

2.5 線粒體損傷的H9C2心肌細(xì)胞中HSF1表達(dá)升高

在H2O2刺激后心肌細(xì)胞中HSF1的表達(dá)升高(1.550±0.180vs2.321±0.240,P=0.027)(圖5)，線粒體的損傷與HSF1的表達(dá)存在一定的關(guān)系。

3 討論

衰老是機(jī)體多個(gè)器官的生理功能隨著年齡的增長而逐步減退的過程，引起衰老的原因包括線粒體DNA(mtDNA)突變[9]、氧自由基損傷[10]、DNA損傷[11]等。心臟是重要的能量代謝器官，在心肌細(xì)胞中，線粒體體積約占心肌細(xì)胞總?cè)莘e的1/3，并提供心肌所需的90%以上的能量[12]，在心臟功能維持方面起著重要的作用。不僅如此，線粒體還是自由基和ROS的主要來源，研究表明，當(dāng)線粒體的損傷導(dǎo)致其功能發(fā)生紊亂時(shí)，可直接導(dǎo)致心肌氧化應(yīng)激水平的升高[13]，而ROS是介導(dǎo)衰老相關(guān)細(xì)胞損傷的主要物質(zhì)[14]，故而線粒體被認(rèn)為是介導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老的關(guān)鍵細(xì)胞器。而在本實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)心肌組織中線粒體的結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能變化進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在衰老心肌中線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，同時(shí)衰老心肌中ATP的含量下降，ROS的含量上升，與文獻(xiàn)研究[13-14]結(jié)果一致。

圖5 H2O2 刺激引起H9C2細(xì)胞中HSF1的表達(dá)升高Fig.5 Expression of HSF1 in H9C2 cells after H2O2 treatment compared with H9C2 cell

HSF1是熱休克蛋白以及應(yīng)激蛋白的主要調(diào)控因子，參與細(xì)胞的分化、應(yīng)激反應(yīng)。有文獻(xiàn)[15]表明，HSF1可保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血/再灌注損傷，相關(guān)的熱休克蛋白也可發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用以此來對(duì)抗化療藥物的引起的心肌毒性損傷[16]，同時(shí)誘導(dǎo)熱休克反應(yīng)還可減輕心房顫動(dòng)[17]。也有研究[18]顯示在氟化物造成的急性損傷中 HSF1在心肌中的表達(dá)升高，HSF1還可通過阻斷Smad3的激活而作為一種新型的心肌纖維化負(fù)性調(diào)節(jié)劑來抵抗心肌纖維化[19]， 這些充分說明了HSF1在心臟疾病中發(fā)揮的重要作用。同時(shí)HSF1也參與衰老[20]、神經(jīng)變性[21]、癌癥[22]等相關(guān)疾病，在維持細(xì)胞內(nèi)平衡等方面發(fā)揮著十分重要的作用。

HSF1的降低可使DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老[23]，衰老大鼠的骨骼肌中HSF1的表達(dá)升高，這些都提示HSF1參與衰老的進(jìn)程。但是在衰老的心肌中HSF1的變化并不清楚，因此在本研究中對(duì)小鼠心肌組織中HSF1的表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)在衰老小鼠心肌中HSF1的表達(dá)升高，明確了HSF1在衰老心肌中表達(dá)的變化。有研究[24]顯示，心肌缺血再灌損傷、膿毒血癥等因素可誘導(dǎo)HSF1的產(chǎn)生，且在這些過程中均伴隨著ROS的增加，另有研究[25-26]顯示在肝癌細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生可以使HSF1激活，這些都表明HSF1和ROS之間有密切的聯(lián)系。

為了進(jìn)一步探究線粒體損傷與HSF1之間的關(guān)系，筆者用H2O2刺激H9C2細(xì)胞構(gòu)建線粒體損傷的模型，并檢測相關(guān)指標(biāo)評(píng)估線粒體的功能，JC-1 是一種線粒體定位的熒光染料，可以反映線粒體膜電位的變化，細(xì)胞在正常的情況下，JC-1 以紅色聚合體(JC-1 aggregates)的形式存在，當(dāng)線粒體出現(xiàn)膜電位下降時(shí)，JC-1 可轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色單體(JC-1 monomer)。

在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)在衰老的心肌中線粒體發(fā)生損傷，同時(shí)心肌組織中ROS的生成增多，且與HSF1的表達(dá)呈正相關(guān)。所以本研究推測線粒體損傷過程中ROS的變化可能會(huì)引起HSF1表達(dá)的改變，在小鼠的心肌組織中檢測到了線粒體的損傷及ROS含量的升高，而H2O2作為氧化應(yīng)激模型的常用藥物可以使ROS含量升高，使細(xì)胞線粒體發(fā)生損傷，因此本研究用H2O2刺激H9C2細(xì)胞構(gòu)建線粒體損傷的細(xì)胞模型，通過檢測細(xì)胞中ATP及ROS的變化及線粒體膜電位的變化來評(píng)價(jià)線粒體的功能，結(jié)果顯示在線粒體損傷的心肌細(xì)胞模型中ATP含量下降，ROS含量上升，線粒體膜電位下降，隨后檢測HSF1表達(dá)的變化，結(jié)果顯示線粒體損傷后HSF1的表達(dá)升高，初步揭示在衰老的心肌中HSF1表達(dá)的變化與線粒體是損傷之間存在著一定的聯(lián)系。

以上研究結(jié)果表明，在衰老心肌中線粒體的形態(tài)和功能損傷，HSF1的表達(dá)升高，且與線粒體的功能呈負(fù)相關(guān)。本研究初步揭示了衰老心肌中HSF1表達(dá)與線粒體損傷的關(guān)系，為研究心肌衰老及線粒體損傷提供新的線索，同時(shí)也為衰老相關(guān)心血管疾病的治療提供了新的思路。

[1] North B J, Sinclair D A. The intersection between aging and cardiovascular disease[J]. Circ Res,2012,110(8):1097-1108.

[2] Ussher J R, Lopaschuk G D. The malonyl CoA axis as a potential target for treating ischaemic heart disease[J]. Cardiovasc Res, 2008,79(2): 259-268.

[3] Barja G， Herrero A. Oxidative damage to mitochondrial DNA is inversely related to maximum life span in the heart and brain of mammals[J]. FASEB J,2000,14(2):312-318.

[4] Dorn G W, Kitsis R N. The mitochondrial dynamism-mitophagy-cell death interactome: multiple roles performed by members of a mitochondrial molecular ensemble[J]. Circ Res,2015,116(1):167-182.

[5] Hall A R，Burke N，Dongworth R K，et al. Hearts deficient in both Mfn1 and Mfn2 are protected against acute myocardial infarction[J]. Cell Death Dis,2016,7 (5) :e2238.

[6] Christians E S, Yan L J, Benjamin I J. Heat shock factor 1 and heat shock proteins：critical partners in protection against acute cell injury[J]. Crit Care Med,2002,30(1 Suppl):S43-S50.

[7] Karvinen S, Silvennoinen M, Vainio P, et al. Effects of intrinsic aerobic capacity, aging and voluntary running on skeletal muscle sirtuins and heat shock proteins[J]. Exp Gerontol, 2016,79(6):46-54.

[8] Lee J H, Lee Y K, Lim J J, et al.Mitochondrial respiratory dysfunction induces claudin-1 expression via reactive oxygen species-mediated heat shock factor 1 activation,leading to hepatoma cell invasiveness[J]. J Biol Chem,2015,290(35):21421-21431.

[9] Labunskyy V M, Gladyshev V N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging[J]. Antioxid Redox Sign, 2013, 19(12): 1362-1372.

[10] Park C B, Larsson N G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging[J]. J Cell Biol, 2011, 193(5): 809-818.

[11] Ou H L,Schumacher B.DNA damage responses and p53 in the aging process[J].Blood,2018,131(5):488-495.

[12] Liu Y, Sato T, O’Rourke B, et al. Mitochondrial ATP-dependent potassium channels: novel effectors of cardioprotection[J]. Circulation,1998, 97(24): 2463-2469.

[13] Liu J, Cao L, Chen J C, et al. Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway[J]. Nature,2009,459(7245):387-392.

[14] Chakrabarti S, Munshi S, Banerjee K, et al. Mitochondrial dysfunction during brain aging: role of oxidative stress and modulation by antioxidant supplementation [J]. Aging Dis,2011,2(3):242-256.

[15] Zou Y, Zhu W, Sakamoto M, et al. Heat shock transcription factor 1 protects cardiomyocytes from ischemia/reperfusion injury[J].Circulation, 2003,108(24):3024-3030.

[16] Venkatakrishnan C D, Tewari A K,Moldovan L, et al. Heat shock protects cardiac cells from doxorubicin-induced toxicity by activating p38 MAPK and phosphorylation of small heat shock protein 27[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291(6):2680-2691.

[17] Brundel B J, Shiroshita-Takeshita A, Qi X, et al. Induction of heat shock responde protects the heart against atrial fibrillation[J]. Circ Res,2006,99(12):1394-1402.

[18] Panneerselvam L, Raghunath A, Perumal E. Differential expression of myocardial heat shock proteins in rats acutely exposed to fluoride[J]. Cell Stress Chaperones,2017, 22(5):743-750.

[19] Zhou N, Ye Y, Wang X, et al. Heat shock transcription factor 1 protects against pressure overload-induced cardiac fibrosis via Smad3[J]. J Mol Med (Berl),2017,95(4):445-460.

[20] Hensen S M, Heldens L, van Genesen S T, et al. A delayed antioxidant response in heat-stressed cells expressing a non-DNA binding HSF1 mutant[J]. Cell Stress Chaperones,2013,18(4):455-473.

[21] Verma P, Pfister J A, Mallick S, et al. HSF1 protects neurons through a novel trimerization-and HSP-independent mechanism[J]. J Neurosci,2014,34(5): 1599-1612.

[22] Theriault B L, Basavarajappa H D, Lim H, et al. Transcriptional and epigenetic regulation of KIF14 overexpression in ovarian cancer[J]. PLoS One,2014, 9(3): e91540.

[23] Kim G, Meriin A B, Gabai V L, et al. The heat shock transcription factor Hsf1 is downregulated in DNA damage-associated senescence, contributing to the maintenance of senescence phenotype[J]. Aging Cell,2012,11(4):617-627.

[24] Christians E S, Yan L J, Benjamin I J.Heat shock factor 1 and heat shock proteins: Critical partners in protection against acute cell injury[J]. Crit Care Med,2002,30(Suppl 1):S43-S50.

[25] Ozaki M, Deshpande S S, Angkeow P, et al. Rac1 regulates stress-induced redox-dependent heat shock factor activation[J]. J Biol Chem,2000,275(45)：35377-35383.

[26] 費(fèi)碩,鄭桓,張義東,等.鋅離子在心肌線粒體保護(hù)作用中的研究進(jìn)展[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2016，19(3)：489-492.