段向輝 常 娜 李麗英

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，‘肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)’北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

肝纖維化嚴(yán)重危害著人類的健康，但迄今為止卻沒(méi)有一個(gè)有效的治療手段。在纖維化早期階段，骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞會(huì)向肝臟浸潤(rùn)，并分化成炎性巨噬細(xì)胞，分泌一些炎性反應(yīng)因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)、人巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β(macrophage inflammatory protein-1β,MIP-1β)、白細(xì)胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、IL-10等。炎性細(xì)胞因子可以清除有害物質(zhì)并啟動(dòng)組織修復(fù)過(guò)程，然而，炎性細(xì)胞因子的持續(xù)存在可能加重肝損傷[1]。在小鼠肝纖維化模型中，筆者觀測(cè)到了大量的骨髓來(lái)源單核巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage，BMMs)浸潤(rùn)于肝損傷區(qū)域，而減少這些細(xì)胞的數(shù)量，可以明顯改善肝功能，減輕炎性反應(yīng)和纖維化[2]，說(shuō)明減少巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)可作為改善肝臟炎性反應(yīng)和纖維化的有效手段。本研究中，筆者將采用巨噬細(xì)胞的細(xì)胞系J774A.1，在體外探究其遷移功能。

大麻素受體1(cannabinoid receptor type 1，CB1)是一種七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，其配體為花生四烯酸乙醇胺(anandamide，AEA)和2-花生四烯酸甘油(2-arachidonoylglycerol，2-AG)。生理情況下，CB1主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在外周組織低表達(dá)。有研究報(bào)道CB1可以影響多種細(xì)胞的遷移，包括神經(jīng)元[3-4]、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[5]、前列腺癌細(xì)胞[6]等。筆者之前的研究[2]表明，在肝損傷時(shí)，CB1介導(dǎo)了骨髓來(lái)源單核巨噬細(xì)胞向肝受損區(qū)域的募集，使用AM281(CB1拮抗劑)抑制CB1功能后，BMMs向肝受損區(qū)域浸潤(rùn)減少，炎性反應(yīng)因子水平和肝纖維化程度均減輕；同時(shí)，小鼠損傷肝組織中CB1 mRNA水平明顯升高，使用siRNA敲減CB1表達(dá)，巨噬細(xì)胞的遷移能力明顯下降。以上結(jié)果表明，CB1表達(dá)的上調(diào)是其介導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移的重要前提，但是分子機(jī)制尚不明確。

MicroRNAs (miRNAs)是一類小非編碼核酸，長(zhǎng)度約為22 nt，對(duì)多種病生理過(guò)程有重要的調(diào)節(jié)作用。miRNAs通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶基因mRNA的3′UTR區(qū)進(jìn)行結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或者使mRNA降解，進(jìn)而降低靶基因的表達(dá)水平[7-8]。目前，已有文獻(xiàn)[9]報(bào)道，miRNAs可以參與多種細(xì)胞的遷移過(guò)程，如miR-1301通過(guò)調(diào)節(jié)p53/UBE4B通路可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，另外miR-449家族則通過(guò)調(diào)節(jié)SOX4表達(dá)而阻斷了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的遷移[10]。同時(shí)miRNAs也是肝纖維化的重要參與者[11]。但是miRNA是否可以通過(guò)調(diào)控CB1表達(dá)來(lái)阻斷巨噬細(xì)胞向損傷肝臟區(qū)域浸潤(rùn)目前尚不得而知。為了解決這一問(wèn)題，筆者通過(guò)生物信息學(xué)的方式從TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)里預(yù)測(cè)了可能靶向CB1的3個(gè)miRNAs：miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p。因此，本研究將在J774A.1細(xì)胞中探討這3個(gè)miRNAs是否可以降低CB1的表達(dá)，進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞的遷移。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠單核巨噬細(xì)胞J774A.1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑與儀器

Opti-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(Gibico 公司，美國(guó))； 胎牛血清(Excell 公司，中國(guó))；青霉素/鏈霉素、β-巰基乙醇、胰蛋白酶(Gibico公司，美國(guó))；ACEA(Arachidonyl-2′-chloroethylamide， TOCRIS/R&D 公司，美國(guó))；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen 公司，美國(guó))；SYBR Green PCR Master Mix(ABI 公司，美國(guó))；Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen 公司，美國(guó))；microRNA mimic(銳博，中國(guó))；Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Kit(銳博，中國(guó))；Boyden chamber(BD 公司，美國(guó))。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 BB16(Heraeus公司，德國(guó))；熒光倒置顯微鏡(Leica公司，德國(guó))；Real-time PCR儀 ABPrism 7300(ABI公司，美國(guó))。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

J774A.1細(xì)胞采用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，放于37℃、5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種密度為1×106/大皿(R=10 cm)或3×105/中皿(R=6 cm)。當(dāng)細(xì)胞匯合度至90%時(shí)進(jìn)行傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 MicroRNA mimic的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天接種3×105個(gè)細(xì)胞于60 mm培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染過(guò)程參照Lipofectamine RNAiMAX Reagent轉(zhuǎn)染步驟。6～8 h后換為完全培養(yǎng)基。所轉(zhuǎn)染的miRNAs的成熟序列如表1所示。

表1 成熟miRNAs序列Tab.1 Sequences of mature miRNAs

1.5 RT-qPCR

采用Gene JET RNA Purification Kit對(duì)細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取。定量后取1g RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(不加反轉(zhuǎn)錄酶作為陰性對(duì)照，即No-RT)。取反轉(zhuǎn)后的cDNA原液進(jìn)行稀釋，然后進(jìn)行qPCR。使用的全部引物序列見(jiàn)表2。檢測(cè)的臨界點(diǎn)設(shè)定在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)(Ct)作為模板初始濃度的間接指標(biāo)，溶解曲線分析采用默認(rèn)條件。結(jié)果以18S rRNA 進(jìn)行校正，用ΔΔCt 法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。

表2 引物序列Tab.2 Sequences of primers for real-time RT-PCR

1.6 Boyden chamber遷移實(shí)驗(yàn)

遷移實(shí)驗(yàn)前24 h，對(duì)J774A.1細(xì)胞更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基饑餓處理，胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。以4104/孔(體積為200L)的細(xì)胞密度接種到Boyden chamber小室中，小室下層加入700L無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基(ACEA作為刺激因子加入下室，終濃度為1mol/L)，置于37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱里遷移6 h。遷移結(jié)束后，棄培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的甲醇固定30 min，PBS清洗3次。用蘇木精染色1 h，PBS清洗3次，然后用醫(yī)用棉簽輕輕擦去上層未遷移至底面的細(xì)胞。于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，每孔拍取5個(gè)視野，對(duì)遷移的細(xì)胞計(jì)數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p與CB1 mRNA 可能的結(jié)合關(guān)系

采用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到了3個(gè)最有可能靶向CB1的miRNAs：miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p。它們的評(píng)分(Context+ score percentile)均高于90(參見(jiàn)http://www.targetscan.org/mmu_71/)，表明這3個(gè)miRNAs靶向CB1 mRNA的可能性較大。miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p與CB1 mRNA 3′UTR的結(jié)合關(guān)系如圖1所示。

2.2 miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p抑制了ACEA誘導(dǎo)的CB1表達(dá)上調(diào)

為了研究這3個(gè)miRNAs是否可以影響CB1的表達(dá)，筆者分別轉(zhuǎn)染了J774A.1細(xì)胞的mimics，轉(zhuǎn)染第2天，對(duì)細(xì)胞饑餓4 h后，再使用1μmol/L ACEA處理8 h，收集細(xì)胞，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)CB1 mRNA表達(dá)及miRNAs表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入相應(yīng)miRNAs mimics后，J774A.1細(xì)胞里miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p的水平分別上升了1 457.61倍、257.13倍和11 418.38倍(P<0.05)，其倍數(shù)的差異與這3個(gè)miRNAs的基礎(chǔ)表達(dá)有關(guān)，正常J774A.1細(xì)胞里miR-29b-3p表達(dá)最高，miR-29a-3p其次，miR-29c-3p最低；這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)染是有效的，足以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。同時(shí)，ACEA上調(diào)了J774A.1細(xì)胞內(nèi)的CB1表達(dá)水平，而轉(zhuǎn)染了miR-29a-3p、miR-29b-3p或miR-29c-3p的mimics均可以明顯抑制ACEA的作用(圖2)。

圖1 miR-29a/b/c-3p與CB1 3′UTR的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)Fig.1 The predicted binding sites betweenmiR-29a/b/c-3p and CB1 3′UTR

圖2 miR-29a/b/c-3p mimics 抑制了ACEA誘導(dǎo)的CB1 mRNA的上調(diào)Fig.2 miR-29a/b/c-3p mimics inhibit the upregulation of CB1 mRNA expression

2.3 miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p抑制了ACEA誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞的遷移

接下來(lái)，筆者檢測(cè)了miR-29a-3p、miR-29b-3p和miR-29c-3p是否可以影響J774A.1細(xì)胞的遷移。為了解決這一問(wèn)題，筆者分別轉(zhuǎn)染了J774A.1細(xì)胞的miRNAs mimics，48 h后收集細(xì)胞，重新接種到Boyden chamber小室中，下室加入ACEA(終濃度為1μmol/L)。6 h后進(jìn)行細(xì)胞固定、染色操作，然后觀察拍照計(jì)數(shù)。對(duì)照組的結(jié)果顯示，1μmol/L 的ACEA可以明顯促進(jìn)J774A.1細(xì)胞的遷移，為對(duì)照組的1.94倍，而轉(zhuǎn)染了miR-29a-3p mimic之后，ACEA便失去了促遷移的作用。同樣，在轉(zhuǎn)染miR-29b-3p mimic和miR-29c-3p mimic的細(xì)胞中，結(jié)果也是如此(圖3)。這表明這3個(gè)miRNAs通過(guò)影響CB1的表達(dá)，抑制了ACEA誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞的遷移。

3 討論

過(guò)去十幾年來(lái)，越來(lái)越多的文獻(xiàn)[12-14]報(bào)道內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)參與了急性與慢性肝臟疾病，并扮演著重要的角色。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)包括兩個(gè)受體(CB1和CB2)，兩個(gè)配體：花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯酸甘油(2-AG)，以及相應(yīng)的合成酶與降解酶。其中CB1參與了酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝硬化等肝病的病理過(guò)程以及肝再生過(guò)程[12]。有文獻(xiàn)[13]報(bào)道抑制肝臟CB1表達(dá)后，可以改善糖和脂質(zhì)代謝，減少肝臟脂肪變性。還有文獻(xiàn)[14]報(bào)道，藥理學(xué)上阻斷CB1功能后，可以改善肝臟纖維化，即便是已經(jīng)出現(xiàn)了肝硬化的情況下?？梢?jiàn)阻斷CB1可以作為治療一些肝病的手段，但其中的機(jī)制尚不完全清楚。

目前，有大量報(bào)道[15-16]表明CB1可參與多種細(xì)胞的遷移。例如，CB1可激活PI3K/Akt和ERK1/2信號(hào)通路，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移[15]。而CB1激動(dòng)劑也可以濃度依賴的方式誘導(dǎo)人胚腎293細(xì)胞的遷移，且AMPK信號(hào)通路的激活可能參與其中[16]。在本研究中，筆者證明了CB1激動(dòng)劑ACEA可以誘導(dǎo)J774A.1細(xì)胞的遷移，而miR-29a/b/c的mimics可以通過(guò)降低CB1的表達(dá)來(lái)抑制這一過(guò)程。另外，本研究顯示CB1激動(dòng)劑ACEA可以上調(diào)CB1的表達(dá)，且該過(guò)程依賴于miR-29a/b/c-3p。

近些年來(lái)，miRNAs引起了越來(lái)越多的關(guān)注。做為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，miRNAs參與了諸多生物學(xué)過(guò)程。

圖3 miR-29a/b/c-3p mimics阻斷了ACEA誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞的遷移Fig.3 miR-29a/b/c-3p mimics blockACEA-induced J774A.1 cells migration.

人類的基因組可以編碼超過(guò)1 000種miRNAs，它們可以靶向約60%的人類基因[17-18]。miRNAs可以靶向和調(diào)控所有的生物過(guò)程和細(xì)胞類型，并影響幾乎所有細(xì)胞中基因的表達(dá)。有研究[19]報(bào)告已經(jīng)證明，在肝臟中，miRNAs水平的改變與各種肝病，包括病毒性肝炎、酒精和非酒精性脂肪性肝炎，藥物誘發(fā)的肝損傷、自身免疫性肝病和缺血再灌注損傷相關(guān)。植物的miRNAs發(fā)揮作用時(shí)，通常與其靶mRNA具有近乎完美的配對(duì)[20-21]，而動(dòng)物的miRNA能夠通過(guò)在miRNA的5′末端使用少至6～8個(gè)核苷酸(種子區(qū)域)來(lái)識(shí)別其靶mRNA[21]，因此在動(dòng)物中種子序列也是區(qū)分miRNAs之間不同功能的一個(gè)標(biāo)志。本研究中所關(guān)注的miR-29a-3p、miR-29b-3p以及miR-29c-3p，它們的種子序列均為：5′-ACCACGA-3′，在CB1 mRNA 3′UTR上的結(jié)合位點(diǎn)(預(yù)測(cè))均為2 343～2 349位堿基。因此，在本研究中三者均可以抑制ACEA誘導(dǎo)的CB1的上調(diào)和J774A.1細(xì)胞的遷移。目前有許多報(bào)道[22-23]指出miR-29家族參與了肝臟纖維化進(jìn)程，例如miR-29家族可以抑制肝星狀細(xì)胞的激活[22]，另外也可以抑制成纖維細(xì)胞內(nèi)膠原的合成[23]。而筆者的結(jié)果第一次證實(shí)miR-29a/b/c-3p參與了巨噬細(xì)胞的遷移，進(jìn)一步完善了對(duì)于miR-29家族在肝纖維化過(guò)程中功能的認(rèn)識(shí)。

巨噬細(xì)胞在獲得性免疫與固有免疫系統(tǒng)中都發(fā)揮著十分重要的作用。當(dāng)組織受到感染或損傷時(shí)，循環(huán)系統(tǒng)中的炎性單核細(xì)胞(Ly6C+細(xì)胞)會(huì)受到招募，進(jìn)入受損組織區(qū)域，并分化成巨噬細(xì)胞發(fā)揮作用[24]。在早期階段，這些被招募的巨噬細(xì)胞常常表現(xiàn)出促炎性反應(yīng)表型，分泌一些炎性反應(yīng)因子：TNF-α、IL-1和一氧化氮(nitric oxide, NO)，激活抗菌防御機(jī)制。在許多慢性炎性反應(yīng)和自身免疫性疾病中，如果炎性巨噬細(xì)胞反應(yīng)一直存在而得不到控制，反過(guò)來(lái)還可以促進(jìn)疾病的進(jìn)展[25-26]。因此，如果可以控制巨噬細(xì)胞向組織的浸潤(rùn)，那么便可以控制炎性反應(yīng)的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果[2]表明，在四氯化碳造成的小鼠肝損傷模型中，小鼠肝臟中聚集了大量的巨噬細(xì)胞，肝臟發(fā)生炎性反應(yīng)及纖維化；而預(yù)防性給予小鼠CB1 拮抗劑AM281后，巨噬細(xì)胞向受損肝臟部位的浸潤(rùn)被阻斷，肝臟的炎性反應(yīng)及纖維化得到有效緩解[2]。目前已有文獻(xiàn)[27]報(bào)道CB1拮抗劑(利莫那班)可以緩解急性或慢性肝損傷，但是會(huì)引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)，比如抑郁等，這表明CB1拮抗劑可能并不適合作為藥物應(yīng)用于臨床。因此，是否可以找到其他因子代替CB1拮抗劑抑制CB1表達(dá)或功能，從而達(dá)到治療疾病的效果便顯得極為重要?；趍iRNAs的功能與安全性，其作為藥物受到越來(lái)越多研究者的青睞，目前已有一些miRNA藥物進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段，如用于治療肝癌的miR-34a(參見(jiàn)www.clinicaltrails.gov/ct2/show/NCT01829971)[28-29]。筆者著眼于miRNA是否可作為一個(gè)替代藥物，調(diào)控CB1的表達(dá)和功能。本研究在體外證明了miR-29-a/b/c-3p可以通過(guò)靶向CB1，從而影響J774A.1細(xì)胞的遷移。表明miR-29家族或許可以作為藥物，達(dá)到治療肝纖維化的效果，但該結(jié)果仍需在小鼠和人體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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