宋麗妮 曹 曦 劉 薇 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100730；2.糖尿病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病)、糖尿病心肌病及糖尿病腎病中起重要作用。ACE2-Ang-(1-7)-MAS軸作為新發(fā)現(xiàn)的 RAS 調(diào)節(jié)軸, 可拮抗經(jīng)典軸ACE/AngⅡ/AT1(Ang Ⅱ type 1 receptor)的生物效應(yīng)[1]。近年來(lái)，研究[2]顯示肝細(xì)胞的異常凋亡與各種急、慢性肝病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后以及肝臟惡性腫瘤的形成密切相關(guān)。肝臟作為胰島素作用的主要靶器官，同時(shí)也是脂代謝的重要器官，對(duì)于機(jī)體糖脂代謝的調(diào)節(jié)起著十分重要的作用，肝細(xì)胞的過(guò)度凋亡，可嚴(yán)重影響肝臟功能，從而引起或加重糖、脂代謝紊亂。目前，有研究[3-7]表明ACE2過(guò)表達(dá)可以改善氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，從而減少小鼠胰島細(xì)胞[3]與肺內(nèi)皮細(xì)胞[4]、大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞[5]、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[6]以及心肌細(xì)胞[7]的凋亡，但其對(duì)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)與凋亡的影響及具體機(jī)制尚不明確。本文將通過(guò)以棕櫚酸處理人肝癌細(xì)胞(HepG2 cell)誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞模型探討ACE2對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡雄性野生型C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～24 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京) 2016-0011，ACE2-/y小鼠由Prof. Dr. Josef Penninger from Institute for Molecular Biotechnology GmbH教授饋贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)所使用的所有動(dòng)物均經(jīng)過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)，SPF級(jí)別動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞資源中心(Cell Resource Center, IBMS, CAMS /PUMC)，用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM 進(jìn)行體外培養(yǎng)(100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素)，調(diào)整細(xì)胞密度為 2×105個(gè)/mL， 分別接種于96 孔板、6孔板，置37 ℃ 、5% (體積分?jǐn)?shù))CO2飽和濕度的 CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。 HepG2 細(xì)胞在Ad-rACE2-eGFP[adenovirus coding for rat ACE2 (rACE2) upstream of an enhanced green florescent protein，購(gòu)自Sino-GenoMax, China]病毒(1.0×107pfu/mL)或?qū)φ誂d-eGFP(adenovirus of an enhanced green florescent protein)病毒(1.0×107pfu/mL)孵育24 h后熒光顯微鏡觀察病毒感染效率。

1.3 細(xì)胞活性檢測(cè)(MTT)法

以不同濃度(0、0.25、0.4、0.8、1.0 mmol/L)棕櫚酸[8]分別處理已感染ACE2腺病毒或GFP病毒的HepG2細(xì)胞，于各組中(96孔培養(yǎng)板)加入MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide, 美國(guó)Sigma公司]10 μL置37 ℃孵箱孵育4 h，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌兩次，每孔加150 μL 二甲基亞砜(DMSO, 美國(guó)Sigma公司)，振蕩，孵育30 min，置多功能酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)每孔570 nm 吸光度值。

1.4 TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡

采用北京全式金生物公司(TransGen Biotech)提供的TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定同周齡雄性ACE2-/y和C57BL/6小鼠肝臟中的細(xì)胞凋亡情況。具體步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。高倍熒光顯微鏡(Leica)隨機(jī)選取4個(gè)視野進(jìn)行觀察，與細(xì)胞核重疊并且發(fā)綠光的為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡肝細(xì)胞。

1.5 RNA 的提取和實(shí)時(shí)定量 RT-PCR

應(yīng)用Trizol法抽提HepG2細(xì)胞總RNA(Invitrogen公司，美國(guó))，以2 mg RNA 為模板利用Rever TraAceqPCR RT試劑盒(Toyobo 公司，日本) 反轉(zhuǎn)出cDNA。利用ABI GeneAmp 5700PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems公司，美國(guó))，SYBR Green PCR master mix反應(yīng)液檢測(cè)RNA 的表達(dá)。 經(jīng)分析系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)表達(dá)的定量。 引物序列如表1。

1.6 Western blotting

在4 ℃條件下，加入裂解液提取HepG2細(xì)胞蛋白。用BCA蛋白分析試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。每個(gè)樣本取30 ～ 60 μg蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)上，用含5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉的TBST[TBS+0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Tween-20]溶液封閉1.5 h，用封閉液將一抗按照一定比例稀釋(抗Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3、JNK、P-JNK、CHOP、beta-actin抗體均購(gòu)自Cell signaling technology，抗ACE2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)，將膜與一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日TBST漂洗3次，每次5 min，再與辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，以肌動(dòng)蛋白(beta-actin)作為內(nèi)參，滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)發(fā)光液后用Chemi-Doc Touch凝膠成像系統(tǒng)顯影成像，并用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。分別計(jì)算出Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3、JNK、P-JNK和CHOP與內(nèi)參beta-actin的吸光度積分值之比分別作為其相對(duì)含量值。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ACE2載體感染HepG2細(xì)胞

將Ad-rACE2-eGFP和Ad-eGFP分別感染HepG2細(xì)胞，24 h后觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。兩種GFP熒光均有明顯表達(dá)，兩種腺病毒均成功感染HepG2細(xì)胞(圖1A)。采用Western blotting檢測(cè)ACE2蛋白在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，ACE2蛋白在HepG2細(xì)胞中有表達(dá)，GFP組相較正常對(duì)照組ACE2的表達(dá)有增長(zhǎng)趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而HepG2細(xì)胞經(jīng)ACE2腺病毒感染的ACE2組相較于control組和GFP組其ACE2蛋白的表達(dá)顯著增加，其中ACE2組相較于GFP組其ACE2蛋白的表達(dá)明顯增加且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05，圖1B)。

2.2 ACE2改善了棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的凋亡

HepG2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染Ad-rACE2-eGFP或Ad-eGFP后以不同濃度棕櫚酸處理24 h。MTT結(jié)果顯示，兩組隨著棕櫚酸濃度的增加細(xì)胞活性均逐漸下降，當(dāng)棕櫚酸濃度分別為0.4、0.8、1.0 mmol/L時(shí)過(guò)表達(dá)ACE2的HepG2細(xì)胞活性明顯高于對(duì)照GFP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中棕櫚酸濃度為0.4 、1.0 mmol/L時(shí)(P<0.05)，棕櫚酸濃度為0.8 mmol/L時(shí)過(guò)表達(dá)ACE2組較對(duì)照GFP組其細(xì)胞存活率顯著增加(P<0.001)，詳見(jiàn)圖2。

2.3 ACE2敲除小鼠肝細(xì)胞凋亡增多

同周齡成年雄性ACE2敲除小鼠的肝臟石蠟切片經(jīng)TUNEL染色結(jié)果顯示，其凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于野生型C57BL/6小鼠(圖3)。ACE2基因的敲除增加了肝細(xì)胞的凋亡。

2.4 ACE2對(duì)凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

將ACE2過(guò)表達(dá)于HepG2細(xì)胞后，采用RT-PCR方法檢測(cè)凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因水平的表達(dá)。ACE2過(guò)表達(dá)HepG2細(xì)胞后，與對(duì)照GFP組相比，抗凋亡基因Bcl-2的mRNA明顯升高，而促凋亡基因Bax、caspase-3、caspase-12的mRNA均顯著降低，ACE2有抑制細(xì)胞凋亡的作用(圖4A)。與此同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路相關(guān)IRE1a、Xbp1、PERK、ATF6、GRP78、CHOP、GADD34的mRNA水平均顯著降低圖4B。

2.5 ACE2對(duì)凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

將ACE2過(guò)表達(dá)于HepG2細(xì)胞后，檢測(cè)凋亡通路相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3、P-JNK、JNK、CHOP)的表達(dá)。Western blotting分析結(jié)果顯示，經(jīng)PA處理的3組之間總的caspase-3和JNK的表達(dá)均無(wú)差異。同時(shí)，經(jīng)PA處理的GFP組相較于正常對(duì)照組Bcl-2、Bax、P-JNK以及CHOP的表達(dá)無(wú)差異，其中cleaved-caspase-3有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而ACE2組與GFP組比較，抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高，其凋亡通路相關(guān)基因Bax、cleaved-caspase-3、P-JNK、CHOP蛋白水平顯著降低(圖5，P<0.05)。

圖2 MTT法檢測(cè)不同處理下細(xì)胞活性Fig.2 MTT assay measuring cell viability in HepG2 cells

3 討論

糖尿病作為一種以自身胰島素分泌不足和胰島素抵抗為主要特征的疾病，發(fā)病率逐年升高。肝臟作為糖脂代謝的主要器官，肝臟胰島素抵抗被認(rèn)為是2 型糖尿病的主要原因之一，并且在糖尿病不斷發(fā)展的過(guò)程中也同樣會(huì)導(dǎo)致一系列的肝功能損傷，從而形成惡性循環(huán)[9]。所以，肝細(xì)胞的正常代謝與生長(zhǎng)狀態(tài)直接影響著機(jī)體的糖脂代謝平衡。本課題組[3]的前期研究表明，ACE2基因敲除的小鼠表現(xiàn)為糖耐量受損及胰島素分泌功能障礙，而ACE2的上調(diào)可以通過(guò)減少胰島細(xì)胞的氧化應(yīng)激與凋亡從而對(duì)胰島素分泌起到保護(hù)作用。筆者研究結(jié)果表明，ACE2敲除小鼠肝臟中凋亡的肝細(xì)胞明顯增多，而在棕櫚酸處理下經(jīng)ACE2過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞活力顯著增高。所以，ACE2與肝細(xì)胞凋亡之間存在一定的聯(lián)系，并且ACE2基因敲除小鼠表現(xiàn)的糖耐量受損很可能與肝細(xì)胞凋亡增多有關(guān)。

圖3 細(xì)胞原位TUNEL法(綠色)檢測(cè)肝細(xì)胞的凋亡Fig.3 Liver cell apoptosis detected by TUNEL(green)

圖4 ACE2對(duì)凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of ACE2 on apoptosis and endoplasmic reticulum stress-related gene expression

棕櫚酸可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生脂毒性從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[10]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)早期，ER通過(guò)減少蛋白合成以及降解蓄積的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞正常功能，但當(dāng)ERS過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)久，細(xì)胞通過(guò)激活非折疊蛋白反應(yīng)(unfold protein response, UPR)[11]，繼而誘導(dǎo)ERS下游C-Jun氨基酸末端激酶(JNK)、C/EBP同源蛋白(CHOP)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(caspase-12)基因的表達(dá)[12]，最終直接或間接的引起級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng)，激活下游的caspase-3從而引起細(xì)胞凋亡[13]。Caspase-3通路是經(jīng)典的凋亡通路，其表達(dá)上調(diào)提示細(xì)胞凋亡水平的增加[14]。在本研究中，筆者以棕櫚酸處理HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡為模型，并以ACE2過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上檢測(cè)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的IRE1/JNK/Bax/caspase-3通路，PERK/ATF4/CHOP/caspase-3通路以及caspase-12 基因[15]的表達(dá)均顯著降低。該現(xiàn)象表明ACE2可以通過(guò)抑制caspase-3通路從而減少凋亡的發(fā)生，其機(jī)制可能是ACE2改善了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的水平，從而降低UPR介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

本研究證實(shí)了ACE2可以通過(guò)改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而減少肝細(xì)胞的凋亡，但還存在以下不足：目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為體外實(shí)驗(yàn)，下一步筆者計(jì)劃在ACE2敲除小鼠及高脂喂養(yǎng)小鼠模型上進(jìn)一步觀察ACE2-Ang(1-7)-Mas軸對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及糖脂代謝的影響。目前，ACE2對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響得到證實(shí)，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討，筆者將在線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)方面進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，ACE2上調(diào)可以減少肝細(xì)胞的凋亡，這一過(guò)程可能是通過(guò)降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果進(jìn)一步明確了ACE2在肝細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡中的調(diào)節(jié)作用，并為糖尿病的治療提供了新的線(xiàn)索。

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