羅斌斌 胡亞松 岳 峰,2 陳 彪,2*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心 長壽與老年相關(guān)疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530000; 2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京 100053)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見于老年人的以肢體運(yùn)動(dòng)障礙為臨床特征的神經(jīng)變性疾病[1-3]，全人群患病率大約在0.3%[4]，伴隨年齡的增加而發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2, 5]， 65歲以上人群患病率約是1～2%[3]。PD疾病發(fā)展表現(xiàn)出慢性進(jìn)行性加重的特點(diǎn)[6]，主要病因和病理機(jī)制是在衰老、遺傳和環(huán)境因素共同作用下，中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失引起黑質(zhì)紋狀體多巴胺的下降[7]。

20世紀(jì)80年代中期研究者[8-9]發(fā)現(xiàn)化合物1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)后可以透過血-腦脊液屏障，然后被多巴胺能神經(jīng)元胞體攝取，聚集于線粒體后抑制呼吸鏈ATP合成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而引發(fā)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡。MPTP是目前公認(rèn)的可導(dǎo)致模擬人類PD癥狀的神經(jīng)毒性的物質(zhì)[10]。當(dāng)前PD模型實(shí)驗(yàn)大多來自于嚙齒類低等動(dòng)物，高等動(dòng)物模型較少[5-6, 11]，非人靈長類動(dòng)物具有許多與人類高度相似的生理學(xué)特征，MPTP誘導(dǎo)建立的猴帕金森病模型具有典型代表性[12]，無論是臨床癥狀的變化,還是病理和生物化學(xué)指標(biāo)的改變都與人類原發(fā) PD 十分相似，是進(jìn)行 PD模型研究中的“金標(biāo)準(zhǔn)”[13]。MPTP誘導(dǎo)的模型包括肌肉注射誘導(dǎo)的全身模型和頸內(nèi)動(dòng)脈注射誘導(dǎo)的偏側(cè)模型，前者運(yùn)動(dòng)癥狀明顯持續(xù)，但因生活無法自理，容易死亡，無法開展長期實(shí)驗(yàn)，而后者可利用非受累側(cè)肢體取食，生活質(zhì)量影響不大，但同時(shí)，運(yùn)動(dòng)癥狀變化能否持久相關(guān)研究較少。本課題組利用由研究者判斷的臨床評(píng)分和24 h軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量監(jiān)測(cè)兩個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)頸內(nèi)動(dòng)脈注射MPTP誘導(dǎo)的偏側(cè)PD模型長期運(yùn)動(dòng)癥狀動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司[以下簡稱靈康公司，SYXK(桂)2014-0004]提供，實(shí)驗(yàn)室獲得國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)估和認(rèn)可委員會(huì)(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)認(rèn)證。本研究實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)實(shí)行(AAALAC：WD-0272009)，本研究在靈康公司靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，選取正常雄性食蟹猴(cynomolgus monkeys)作為本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。動(dòng)物環(huán)境溫度23～27 ℃，濕度40%～75%，12 h/12 h光暗交替(7點(diǎn)開燈，19點(diǎn)關(guān)燈)。動(dòng)物早晚飼喂靈長類動(dòng)物飼料[國家標(biāo)準(zhǔn)(GB)14924.8-2001]，午餐提供水果蔬菜， 24 h為動(dòng)物提供不限量的經(jīng)反滲透過濾后的安全飲用水。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑

軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量(physical activity monitoring，PAM)監(jiān)測(cè)器(美國Mini Mitter公司)，便攜式錄像機(jī)(日本Sony公司)，MPTP(美國Sigma公司)。

1.2.2 MPTP誘導(dǎo)食蟹猴偏側(cè)帕金森病模型的建立

5只雄性食蟹猴年齡(5.80±0.44)歲，體質(zhì)量(5.90±0.86)kg，術(shù)前禁食12 h以上，常規(guī)麻醉，氯胺酮(0.1 mL /kg)肌注，術(shù)中持續(xù)異氟烷1%～3%(體積分?jǐn)?shù))吸入麻醉。將裝有 60 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))MPTP 溶液的注射器安裝在MPTP注射泵上，以4 mL/min的速度開始于食蟹猴左側(cè)頸總動(dòng)脈末段注射 MPTP。MPTP 溶液注射(按照2 mg/kg體質(zhì)質(zhì)量)完畢后，逐層縫合頸闊肌、頸前筋膜、皮下組織及皮膚。

1.2.3 臨床評(píng)分

將動(dòng)物轉(zhuǎn)移至錄像單籠，分別于MPTP注射前(基線)，注射后3、6個(gè)月及1、3、6年于清醒狀態(tài)下進(jìn)行行為錄像1 h，通過結(jié)合Kulran(1991)非人靈長類動(dòng)物帕金森病模型臨床評(píng)分量表[14]對(duì)錄像中表現(xiàn)出的臨床癥狀進(jìn)行雙盲評(píng)分。評(píng)分內(nèi)容包括：面部表情(0～3分)、靜止性震顫(0～3分)、動(dòng)作性或意向性震顫(0～3分)、姿勢(shì)(0～2分)、步態(tài)(0～3分)、運(yùn)動(dòng)徐緩(全身)(0～4分)、平衡與協(xié)調(diào)(0～3分)、總體運(yùn)動(dòng)技能(上肢)(0～3分)、總體運(yùn)動(dòng)技能(下肢)(0～3分)、防御反應(yīng)(0～2分)。最小分值為0分，即正常行為為0分，總分最高為29分，即最為嚴(yán)重。

1.2.4 軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量監(jiān)測(cè)

軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量的監(jiān)測(cè)主要包括：硬件設(shè)備中可以記錄運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)活動(dòng)PAM監(jiān)測(cè)器，數(shù)據(jù)發(fā)送、接收的專用讀取器ActiReader以及進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的Actical Software 3.0 軟件。將PAM監(jiān)測(cè)器佩戴于動(dòng)物頸部，監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)為MPTP注射前，注射后3、6個(gè)月及1、6年。每次佩戴結(jié)束后取下PAM監(jiān)測(cè)器，利用ActiReader進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，通過Actical Software 3.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和整理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MPTP誘導(dǎo)的食蟹猴偏側(cè)PD模型

結(jié)合Kulan 帕金森臨床評(píng)分量表[14]來評(píng)判MPTP誘導(dǎo)的偏側(cè)PD模型成功與否，造模前基線臨床評(píng)分均為0分，造模后3個(gè)月內(nèi)臨床評(píng)分穩(wěn)定在10 分以上可作為偏側(cè)PD模型成功構(gòu)建的指標(biāo)。對(duì)5只食蟹猴進(jìn)行行為觀察，造模后2周開始出現(xiàn)精神萎靡、瞌睡、疲倦等急性期反應(yīng)；4周開始出現(xiàn)PD臨床癥狀，主要有運(yùn)動(dòng)緩慢、右側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)能力降低、屈曲身體以及攀爬能力下降，臨床癥狀隨時(shí)間不斷加重；第5周臨床評(píng)分>10分；3個(gè)月臨床評(píng)分(14.65±8.41)最高，出現(xiàn)明顯偏側(cè)PD運(yùn)動(dòng)障礙表現(xiàn)，包括總體活動(dòng)減少，面部表情僵硬(面具臉)，運(yùn)動(dòng)徐緩，右上肢活動(dòng)降低和右手震顫，右下肢運(yùn)動(dòng)減少，防御反應(yīng)減弱，步態(tài)搖晃，身體平衡能力下降，以及不能進(jìn)行攀爬，表明成功構(gòu)建偏側(cè)PD模型。

2.2 食蟹猴偏側(cè)PD模型臨床評(píng)分的長期動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)

與造模后3個(gè)月臨床評(píng)分(14.65±8.41)相比，造模后6個(gè)月(8.10±2.0)較基線仍明顯增高，但與3個(gè)月高峰相期相比顯著降低，造模后1年(7.15±1.48)、3年(4.65±1.01)、6年(4.90±1.94)均較3個(gè)月高峰期明顯下降，但與造模后6個(gè)月的評(píng)分相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)，成模半年后臨床癥狀趨于平穩(wěn)(5分左右)，并維持至少6年。時(shí)間累積對(duì)臨床評(píng)分的影響存在顯著性(F=5.930，P<0.005)。

分別針對(duì)評(píng)分量表中的震顫(tremor)、防御反應(yīng)(defense reaction)、平衡(balance)、姿勢(shì)(posture)、步態(tài)(gait)、右上肢運(yùn)動(dòng)技能(right upper limb motor skills)、右下肢運(yùn)動(dòng)技能(right lower limb motor skills)、運(yùn)動(dòng)遲緩(bradykinesia)8個(gè)評(píng)分要素進(jìn)行獨(dú)立分析，成模后臨床評(píng)分減低的先后順序依次為：震顫>防御反應(yīng)>平衡>姿勢(shì)>步態(tài)>右下肢運(yùn)動(dòng)技能>右上肢運(yùn)動(dòng)技能>運(yùn)動(dòng)遲緩。這些癥狀均在3個(gè)月達(dá)到頂峰，隨后改善，其中震顫6個(gè)月時(shí)基本消失，而右側(cè)肢體的運(yùn)動(dòng)幅度和速度以及運(yùn)動(dòng)遲緩在造模后6年仍存在顯著障礙，防御反應(yīng)、平衡、姿勢(shì)和步態(tài)改善較明顯(圖2)。

2.3 食蟹猴偏側(cè)PD模型軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量的變化

造模后3個(gè)月24 h軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量(16 597.79±12 488.87)較造模前基線(50 084.20±30 170.89)明顯降低(P=0.014)。造模后6個(gè)月24 h軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量(29 278.02±12 264.66)較3個(gè)月時(shí)有明顯恢復(fù)(P=0.016)，但仍顯著低于基線。造模后1年至6年24 h軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量變化與基線相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。時(shí)間累積對(duì)24 h軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量的影響并不明顯(F=2.850，P>0.05)。

圖1 食蟹猴偏側(cè)PD模型造模前基線、造模后3、6個(gè)月及1、3、6年臨床評(píng)分的比較Fig.1 Comparing the clinical scores before and after the modeling of the hemi-Parkinsonian’s model of cynomolgus monkeys at 3, 6 months and 1, 3, and 6 years after modeling

圖2 食蟹猴偏側(cè)PD模型造模前基線、造模后3、6個(gè)月及1、3、6年臨床評(píng)分中各評(píng)分要素評(píng)分均值的變化Fig.2 Comparing the clinical scores before and after the modeling of the hemi-parkinsonian’s model of cynomolgusmonkeys at 3, 6 months and 1, 3, and 6 years after modeling

圖3 食蟹猴偏側(cè)PD模型造模前基線、造模后3、6個(gè)月及1、6年全天24 h軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量的變化Fig.3 Comparing the 24 h physical activity before and after the modeling of the hemi-parkinsonian’s model of cynomolgus monkeys at 3, 6 months and 1, 6 years after modeling

造模后3個(gè)月晝光(12 h)軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量 (14 814.19±12 707.49)較基線(45 743.90±28 587.57)下降明顯(P=0.014)。造模后6個(gè)月晝光(12 h)軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量仍較基線明顯降低(P=0.016)，但造模后1年至6年晝光(12 h)軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量變化與基線相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。時(shí)間累積對(duì)晝光(12 h)軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量的影響并不明顯(F=2.850，P>0.05)。

圖4 食蟹猴偏側(cè)PD模型造模前基線、造模后3、6個(gè)月及1、6年晝光和夜光軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量的比較Fig.4 Comparing the physical activity in day-12 h andnight-12 h before and after the modeling of the hemi-parkinsonian’s model of cynomolgus monkeys at 3 months, 6 months and 1, and 6 years after modeling

造模后3個(gè)月夜光(12 h)軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量(1 783.61±676.08)較基線(4 340.30±2 464.01)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。造模后6個(gè)月夜光(12 h)軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量減少有明顯恢復(fù)，但仍較術(shù)前基線減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)，造模后1年至6年夜光(12 h)軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量變化與基線相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。長時(shí)間的累積對(duì)夜光(12 h)軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量有著顯著的影響(F=3.020，P<0.05)。

3 討論

在MPTP誘導(dǎo)靈長類動(dòng)物PD模型猴的研究中，除Domino等[15]對(duì)PD模型猴進(jìn)行3年的藥效研究和Emborg-Knott等[16]進(jìn)行了6至8年的藥效與行為觀察，鮮有進(jìn)行長期的運(yùn)動(dòng)行為學(xué)動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)研究，尤其是偏側(cè)模型。相比影像學(xué)研究[17-19]和病理學(xué)研究[20-21]，本課題組首次結(jié)合臨床評(píng)分和軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量的監(jiān)測(cè)，來評(píng)價(jià)臨床癥狀的發(fā)展變化，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)的靈長類PD模型運(yùn)動(dòng)行為學(xué)的長期動(dòng)態(tài)研究。

本研究制備的MPTP誘導(dǎo)食蟹猴偏側(cè)PD模型注射后2周開始出現(xiàn)急性期非特異性全身反應(yīng)，4周開始出現(xiàn)PD特異性運(yùn)動(dòng)癥狀，5周臨床評(píng)分已大于10分，表明成功構(gòu)建PD模型[22]；3個(gè)月達(dá)到峰值，總分14左右，6個(gè)月分?jǐn)?shù)降至8分左右，之后至6年后基本穩(wěn)定在5分左右。從這些表現(xiàn)可以將該模型分為以下幾個(gè)階段：①急性期：MPTP注射至第4周，出現(xiàn)的全身癥狀反映了MPTP代謝物MPP+對(duì)外周器官和多巴胺神經(jīng)元的損傷；②進(jìn)展期：第4周至3個(gè)月，從開始出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)癥狀到達(dá)到頂峰值，反映了黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元變性死亡和多巴胺遞質(zhì)的下降；③代償恢復(fù)期：第3個(gè)月至1年，從運(yùn)動(dòng)癥狀達(dá)到頂峰值后下降達(dá)到穩(wěn)定階段(臨床評(píng)分)或完全恢復(fù)(24 h軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量)，反映了肢體或軀體逐漸適應(yīng)了日?；顒?dòng)，源于動(dòng)物體內(nèi)存在自我補(bǔ)償機(jī)制[16]；④慢性期：1年到至少6年，軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量恢復(fù)正常，但受損對(duì)側(cè)肢體隨意活動(dòng)仍然受到多巴胺神經(jīng)元不可逆損傷的影響。

造模后3～6個(gè)月后最為明顯的變化是動(dòng)物的受損側(cè)支配的上肢震顫得到了改善,其部分運(yùn)動(dòng)行為得到緩解，軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)基本恢復(fù)正常，表明動(dòng)物體內(nèi)的自身補(bǔ)償[16]，受損多巴胺能神經(jīng)末梢得到代償，受損側(cè)紋狀體支配的右側(cè)上肢僅可偶爾表現(xiàn)出微弱取食的動(dòng)作，這與模型穩(wěn)定期動(dòng)物右側(cè)上肢運(yùn)動(dòng)技能嚴(yán)重缺失不同[23-24]。由于左側(cè)紋狀體嚴(yán)重不可逆受損，食蟹猴依然保持穩(wěn)定的旋轉(zhuǎn)行為，其支配的右側(cè)上肢隨意運(yùn)動(dòng)技能受限，以致動(dòng)物傾向于使用左側(cè)上肢進(jìn)行精細(xì)運(yùn)動(dòng)，這也可能與偏側(cè)性忽略病癥[25]有關(guān)。6年后食蟹猴運(yùn)動(dòng)徐緩是其臨床癥狀的主要表現(xiàn)，其中致病原因除多巴胺能神經(jīng)元受到影響外，是否有路易小體及α-突觸核蛋白的參與[20]，則需要進(jìn)一步研究。

造模后1年至6年間食蟹猴軀體自發(fā)運(yùn)動(dòng)總量與造模前基線數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，白天自發(fā)活動(dòng)量改善最為明顯，夜間自發(fā)活動(dòng)量也有改善趨勢(shì)。運(yùn)動(dòng)活動(dòng)量為臨床表現(xiàn)的一種量化方式，食蟹猴臨床癥狀得到改善，6年后整體的活動(dòng)量得以恢復(fù)并與基線無異。模型穩(wěn)定期食蟹猴夜間運(yùn)動(dòng)活動(dòng)量顯著下降，可能與夜間運(yùn)動(dòng)功能減退[26]有關(guān)，夜間運(yùn)動(dòng)功能減退是夜間帕金森病的表現(xiàn)，可能需要各種神經(jīng)基質(zhì)和途徑為其執(zhí)行[27]，但是缺乏臨床病理的證明。有研究[28]顯示身體機(jī)能、平衡控制、運(yùn)動(dòng)障礙與身體的活動(dòng)量存在呈正相關(guān)。

與肌肉注射MPTP所致雙側(cè)肢體受累模型猴不同，偏側(cè)模型6個(gè)月至1年之間的代償恢復(fù)期是雙側(cè)模型沒有的[29-30]，此階段不需要給予動(dòng)物左旋多巴即可基本恢復(fù)正常自發(fā)活動(dòng)。在此階段動(dòng)物可通過非受損側(cè)肢體取食而維持基本正常日?；顒?dòng)，避免了較高的病死率且降低了飼養(yǎng)和照料成本；同時(shí)，偏側(cè)模型可用于研究機(jī)體的代償恢復(fù)機(jī)制。

本研究結(jié)果證實(shí)MPTP偏側(cè)猴模型可導(dǎo)致不可逆的紋狀體損害，引發(fā)持久的精細(xì)運(yùn)動(dòng)受損，可作為PD模型動(dòng)物的長期動(dòng)態(tài)和治療評(píng)價(jià)研究，為神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)、細(xì)胞移植等提供重要的參考價(jià)值。

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