周 達， 王 晶， 何玲楠， 李夢婷， 孫 超， 陳源文， 范建高

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200092

脯氨酰寡肽酶(prolyloligopeptidase，POP，EC 3.4.21.26)是一種能特異性水解短肽中脯氨酸殘基羧基端肽鍵的絲氨酸蛋白酶，在體內(nèi)發(fā)揮重要生理功能，參與多肽的生成與代謝、調(diào)控細胞增殖與分化、調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥代謝等[1-3]；但是，POP在外周組織中的具體生物學作用仍未知。肝臟中POP活性很高，提示其在肝內(nèi)生物學功能值得探索[4-6]。同時已有研究[7]發(fā)現(xiàn)，POP參與肝內(nèi)炎癥及肝細胞增殖與分化。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，POP水解胸腺素β4(thymosin β4，Tβ4)產(chǎn)物N-乙?；?絲氨酸-天冬氨酸-賴氨酸-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP)具有抑制肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)活性和抗肝纖維化作用[8-9]；其他研究人員發(fā)現(xiàn)，Tβ4對四氯化碳誘導急性肝毒性有保護作用同時可以抑制HSC活性[10-11]。然而，POP在HSC內(nèi)具體功能尚不明確。

肝纖維化主要表現(xiàn)肝內(nèi)炎癥及細胞外基質(zhì)沉積，HSC起至關重要的作用[12-13]。本研究旨在以HSC作為切入點，通過攜帶POP基因的慢病毒感染HSC-T6，探討POP在HSC內(nèi)的生物學功能，進一步闡明POP在肝臟炎癥與纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞系HSC-T6細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。HSC-T6根據(jù)需要以適當密度接種于不同大小培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為質(zhì)量濃度為100 g/L的FBS/DMEM培養(yǎng)基(血清及培養(yǎng)基均購自Gibco，USA)，置于含體積分數(shù)為5%的CO2孵育箱中，在細胞處于良好生長狀態(tài)時進行下述相關實驗。

1.2攜帶POP基因的慢病毒感染HSC通過PubMed搜索大鼠POP基因(Prep，NM_031324)，設計攜帶POP和綠色熒光蛋白(GFP)基因的慢病毒(POP-virus)及空載病毒(Mock-virus)，并由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司合成；選取不同的病毒感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI值)1、10、100進行感染預實驗，熒光顯微鏡下觀察感染效率，最終將MOI確定為10；接種一定數(shù)量HSC-T6至3.5 cm培養(yǎng)皿24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，隨后參照產(chǎn)品說明書進行感染操作，加入慢病毒或空病毒感染12 h后換液為質(zhì)量濃度為100 g/L的FBS/DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h(根據(jù)細胞密度決定)，同時設立正常對照組，熒光顯微鏡下觀察感染效率，隨后進行各組細胞RNA及蛋白提取及后續(xù)實驗。

1.3ELISA檢測對POP慢病毒組、空病毒組及正常對照組進行細胞內(nèi)Ac-SDKP測定，采用ELISA測定方法，按試劑盒說明書(購自SPI Bio and CEA，F(xiàn)rance)進行。Ac-SDKP的終濃度通過各組細胞數(shù)目進行校正，計算出每106個細胞中Ac-SDKP的量，以(nmol/L)/106表示。

1.4CCK-8細胞增殖毒性檢測將POP慢病毒、空病毒及正常的HSC-T6以相同數(shù)量接種于96孔板中共培養(yǎng)24 h 和48 h，每孔加入200 μl培養(yǎng)液，每孔加入100 μl新鮮培養(yǎng)液，同時設立空白對照組，再加入10 μl CCK-8試劑，避光37 ℃孵育2 h，隨后通過酶標儀(uQuant，Biotek，USA)測定每孔在450 nm處吸光度值(OD值)。各孔OD值均需先減去空白孔OD值后分析各組HSC-T6的增殖生長差異。

1.5細胞凋亡檢測將感染慢病毒、空病毒及正常的HSC-T6以相同數(shù)量接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，使用不含EDTA的胰酶(購自GIBCO，USA)消化提取細胞，然后通過流式細胞學檢測HSC-T6凋亡，具體步驟參照Annexin V-PE/7-AAD凋亡試劑盒(Becton-Dickinson，USA)。

1.6實時定量PCR檢測對POP慢病毒組、空病毒組及正常對照組進行HSC細胞內(nèi)RNA提取，采用Trizol法(Trizol購自Takara)測定各組提取的RNA濃度及純度，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(primescriptRTmaster mix購自Takara)，進而利用cDNA進行熒光定量實時定量PCR(SYBR Premix Ex Taq購自Takara，儀器為Biosystems 7500 Real-time PCR system)檢測POP、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、Ⅰ型膠原(Col I)相關基因mRNA表達量，各基因設置3個復孔，各基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(見表1)，最終結(jié)果使用相對表達量RQ值(2-ΔΔCt)表示，具體操作步驟參考實際說明書。

1.7Westernblotting檢測提取POP慢病毒組、空病毒組及正常對照組細胞內(nèi)蛋白，采用BCA法測定各組蛋白濃度(BCA試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司)。隨后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，質(zhì)量濃度為50 g/L的BSA封閉2 h，各相關蛋白一抗孵育(4 ℃過夜)，1×TBST洗膜10～15 min×3次，二抗孵育1～2 h，1×TBST洗膜10～15 min×3次，最后使用辣根過氧化物酶法檢測(購自Millipore Corporation，Billerica，USA)，使用Image Lab分析蛋白顯影條帶。POP、TGF-β1、α-SMA三者抗體均購自Sigma-Aldrich公司，p-Smad2/3抗體購自巴傲得生物科技有限公司，Smad7、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)購自生工生物工程(上海)股份有限公司，相關二抗及Western blotting相關其他試劑購自碧云天生物技術(shù)有限公司，具體步驟參考相關試劑說明書。

表1 Real-time-PCR引物序列Tab 1 Sequence of primers of Real-time-PCR

注：*:Prep為POP的基因名稱。

2 結(jié)果

2.1慢病毒感染效率48～72 h后進行熒光顯微鏡下GFP檢測，慢病毒及空病毒感染效率均95%以上(見圖1A)，為進一步檢測病毒感染HSC效率，檢測HSC內(nèi)POP的基因及蛋白表達量，慢病毒組POP mRNA和蛋白表達較空病毒組及正常對照組顯著升高(見圖1B～1C)。

2.2POP慢病毒感染對HSC內(nèi)Ac-SDKP水平的影響POP慢病毒組細胞內(nèi)Ac-SDKP較正常對照組及空病毒組顯著升高約50%(P<0.05)，空病毒組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖2A)。

注：con：正常對照組;mock：空病毒組;prep：POP慢病毒組。*P<0.05;**P<0.01。

CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，慢病毒組細胞在24 h及48 h均較正常對照組增殖生長快，在48 h時較空病毒組多增殖約50%，而空病毒組與正常對照組細胞增殖比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖2B)。不同組別HSC-T6相同條件下培養(yǎng)24 h后，HSC-T6凋亡比例雖較其他兩組稍低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖2C)。

2.4POP慢病毒感染對細胞炎癥與纖維化基因mRNA和蛋白表達的影響POP慢病毒組MCP-1及α-SMA mRNA表達均較正常對照組顯著下降，TGF-β1和Col I mRNA表達各組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖3)。POP病毒組α-SMA蛋白表達較正常對照組顯著下調(diào)，而Smad7、PPAR-γ蛋白表達較正常對照組顯著上調(diào)，TGF-β1和p-Smad2/3蛋白表達在各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖4)。

注：con：正常對照組；mock;空病毒組；prep;POP慢病毒組。*P<0.05，**P<0.01，NS：無差異。

注：con：正常對照組；mock：空病毒組；prep：POP慢病毒組。*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

本研究利用攜帶POP基因的慢病毒感染HSC，發(fā)現(xiàn)POP可抑制HSC分泌炎性因子MCP-1及α-SMA的表達，并可能通過上調(diào)Smad7、PPAR-γ的表達抑制HSC的活化，從而具有抗纖維化的作用。

從HSC-T6表達熒光蛋白、胞內(nèi)POP基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達均提示POP慢病毒感染成功，且在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達POP；同時測定各組HSC-T6胞內(nèi)Ac-SDKP水平變化，提示細胞內(nèi)表達的POP存在活性；Ac-SDKP為POP水解Tβ4的產(chǎn)物[14]，具有抗多種器官纖維化作用[8-9,15-16]。本課題組[9]在前期工作中已探索Ac-SDKP抗CCl4誘導肝纖維化的機制，主要為抑制TGF-β1和p-Smad2/3的表達，同時抑制HSC的增殖生長，對Smad7表達無影響。本研究發(fā)現(xiàn)，POP對TGF-β1和p-Samd2/3表達無影響，而是促進Smad7表達，而Smad7為TGF-Smad信號通路抑制蛋白，具有抗纖維化作用。同時研究發(fā)現(xiàn)，POP明顯促進HSC-T6的增殖，與Ac-SDKP作用相反；通過本研究可以推斷水解酶活性僅是POP一小部分功能，POP更重要的功能在于與其他蛋白結(jié)合的協(xié)同作用，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和細胞生長，這種非酶解功能在中樞系統(tǒng)中研究較多[17-19]，在肝臟系統(tǒng)中研究甚少，值得我們進一步深入研究。此外，POP抑制α-SMA和MCP-1的表達，α-SMA為活化HSC的標志，MCP-1為HSC分泌的主要促炎促纖維化因子[20]，與前期Ac-SDKP作用結(jié)果一致。值得一提的是，POP與其下游產(chǎn)物Ac-SDKP在抗肝纖維化效應的具體作用仍不能完全區(qū)分，目前缺乏有效方法可以將Ac-SDKP抑制。

我們還發(fā)現(xiàn)，POP的HSC-T6胞內(nèi)PPAR-γ表達顯著升高，后者最早被認為是重要成脂基因之一[21]，后越來越多證據(jù)證實其為HSC活化和表型轉(zhuǎn)化的關鍵因子，在維持HSC保持靜止狀態(tài)發(fā)揮重要作用，可以抑制α-SMA和TGF-β1等表達，是抑制肝臟炎癥纖維化重要因子[22-23]。另有研究[24-26]發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ可以阻斷TGF-β信號通路及抑制Smad蛋白依賴的啟動子發(fā)揮作用，直接拮抗Smad3在成纖維細胞中的作用，但是不減少Smad3的蛋白表達也不增加Smad7的表達。HSC另外一個特點是儲存維生素A類物質(zhì)，隨著其活化，這種物質(zhì)會逐漸減少直至消失，盡管這種現(xiàn)象與HSC活化、疾病進展關系未完全闡明[27-29]。PPAR-γ可以使HSC恢復這種聚類維生素A物質(zhì)功能，同時減輕胰島素抵抗、脂肪性肝炎[23]，同時我們課題組在近期的研究工作中發(fā)現(xiàn)，POP通過調(diào)控肝細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝合成基因抑制肝細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝[30]；進一步結(jié)合前面所述POP與HSC增殖的關系，表面上POP促進HSC的增殖可促進纖維化進展，但POP促進HSC增殖的同時也使其從活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o止儲脂狀態(tài)，進一步抑制其促纖維化活性[31]。因此，我們推斷POP在脂肪性肝炎及其所致纖維化方面也存在重要作用，同時調(diào)控HSC活性。

注：con:正常對照組；mock組別:空病毒組；prep:POP慢病毒組。*P<0.05,**P<0.01，NS：無差異。

總之，本研究證實了POP蛋白酶在HSC中生物學功能顯著，反映其可能具備肝內(nèi)抗炎、抗纖維化作用，仍需進一步體內(nèi)實驗驗證。但是肝臟系統(tǒng)復雜，本研究僅針對HSC，POP肝內(nèi)具體功能仍存在許多未解之謎，尤其它的非酶解功能，值得進一步深入挖掘探索，可能為肝臟疾病提供新的診療切入點。

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