孫 放

(蘇州大學紡織與服裝工程學院, 江蘇 蘇州 215021)

通過一定濃度的溴化鋰溶液溫度處理脫膠過的蠶絲，可獲得絲素蛋白溶液。天然絲素蛋白因其良好的生物相容性、可降解性、無毒無害、表面有多種官能團(易于各種官能團交聯)、良好的可成型性(可以制成支架、膜、多孔海綿、水凝膠、纖維、顆粒等不同形態(tài))，在生物醫(yī)學等領域有著廣闊的應用前景。三維生物打印是制備支架的一種新方法，利用計算機輔助軟件來設計和制造各種形狀的三維支架，可以精確控制支架的孔徑大小和分布，成型時間短，適合自動化大規(guī)模生產。絲蛋白三維打印存在的一個關鍵問題是如何改善蠶絲蛋白的快速凝膠成型的問題。

1 絲素蛋白的結構性能及應用

1.1 絲素蛋白的結構與理化性能

蠶絲(如圖1所示)的主要成分是絲素和絲膠，絲素蛋白是蠶絲最主要的組成部分，占總質量的70%左右，是一種天然高分子纖維蛋白，含有18種氨基酸以甘氨酸(Glycine)、絲氨酸(Serine)和丙氨酸(Alanine)為主，絲素蛋白包括一條相對分子質量很大的肽鏈(H鏈)、一條相對分子質量小的肽鏈(L鏈)以及p25糖蛋白，絲素存在兩種不同的晶體結構方式，絲素Ι(Silk Ι)和絲素Ⅱ(Silk Ⅱ)，絲素Ι是不穩(wěn)定的而絲素Ⅱ是穩(wěn)定的，絲素Ι經過極性溶劑、稀酸、濕熱等的處理會變成穩(wěn)定的絲素Ⅱ結構[1]。絲素蛋白的結晶部分以β-折疊為主，不能溶于水只能變得膨脹，也不溶于有機溶劑，如乙醇等，但是可以在某些中性鹽溶液中無限擴張而得到粘稠的液體，經過透析除去鹽可得到絲素的純溶液[2]。絲素蛋白具有良好的物理機械性能，如透氣、透濕，緩慢釋放，抗拉強度好、柔韌性好等優(yōu)點。

圖1 蠶絲蛋白的主要成分及結構示意圖

1.2 絲素蛋白的生物性能

絲素蛋白是天然的高分子蛋白，具有很好的生物學性能：(1)安全性：絲素是天然的高純度蛋白質，氨基酸排列順序是已知的，用于手術縫合線已有很長的歷史；(2)可設計性：絲素具有四種高級結構(無規(guī)卷曲、絲素Ι、Ⅱ、Ⅲ型)，它們之間能夠相互轉化，絲素經過不同的處理可以得到各種形態(tài)，如纖維、溶液、粉、膜、水凝膠以及三維支架等，也可以與其他材料復合來改善絲素的結構與性能；(3)生物相容性：多種細胞可以在絲素蛋白上很好地黏附、生長、增殖和分化；(4)特殊的性能：絲素蛋白有良好的機械性能，可以在體內降解并且速度緩慢可調，還擁有良好的促進血管化的能力，優(yōu)良的透水透氧性能[3]。

1.3 絲素蛋白的應用

由于絲素蛋白良好的性能，現已將絲素蛋白用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領域，絲素蛋白可用作人工皮膚、細胞培養(yǎng)基質、生物傳感器、藥物控釋材料、生物酶防護劑、隱形眼鏡、抗凝血材料、酶固定劑等[4]。Meinel等[5]在骨組織修復中使用絲蛋白三維多孔支架，他們的研究表明這種支架穩(wěn)定可靠，可用于骨組織再生修復。Ma Liang等[6]用全物理過程制備三維的多孔絲素蛋白支架，將鼠hMSCs與上述素支架在體外復合培養(yǎng)，實驗結果表明hMSCs能在絲素上良好地粘附、增殖和生長，材料未影響細胞的生長周期，沒有檢測到異倍體細胞，支架材料與hMSCs的生物相容性好。Lin Jing等[7]研究絲素支架的細胞相容性，在絲素多孔支架上培養(yǎng)成纖維細胞、人成骨肉瘤細胞及肝細胞，結構表明這些各種動物細胞能夠很好地黏附生長和繁殖在所制備的絲素多孔支架上。

2 明膠的結構性能及應用

2.1 明膠的結構與性能

A.G.Ward認為，膠原經溫和而不可逆的斷裂后的主要產物為明膠[8]。膠原是大型哺乳動物的骨、皮、肌腱和韌膜等組織細胞外基質的主要成分，對機體和器官起著保護和支撐的作用，膠原具有三股螺旋結構，明膠是膠原的三股螺旋結購破壞后形成的不規(guī)則盤區(qū)的螺旋卷曲狀線性肽鏈分子[9]。明膠分子結構上有大量的極性基團(-OH、-COOH、-NH2)，這使得明膠具有極強的親水性。明膠易溶于溫水，冷卻形成凝膠，不溶于冷水，在冷水中吸水膨脹，不溶于有機溶劑，明膠含有甘氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸及丙氨酸等人體所需的氨基酸，其中甘氨酸占總量的三分之一，脯氨酸和羥基脯氨酸占總量三分之一[10]。

明膠是天然的高分子蛋白，在結構上，明膠與生物組織很相似，明膠除了有很好的生物相容性之外，還有生物可降解性，得到的降解物不容易有炎癥反應且易被吸收，此外還具有低免疫原性、抗氧化性和抗菌性[11]。

2.2 明膠的應用

明膠在食品、照相、化妝品等工業(yè)領域有著廣泛應用。食用明膠可以用于食品添加，提升食品的口感和外觀，營養(yǎng)價值較高；照相明膠主要用于制造感光材料，如拍照時使用的膠卷和膠片等；化妝品中的明膠、膠原及其水解產物對頭發(fā)和皮膚等具有修復、去污、保濕的功效。明膠由于其優(yōu)良的生物性能，在生物醫(yī)藥材料中的應用也很廣泛，明膠可制作藥物膠囊、止血敷料、血液代用品、組織工程支架等[10-11]。

3 絲素蛋白的三維打印

3.1 三維打印及應用

三維打印(Three Dimensional Printing，簡稱3DP)，也稱添加制造(Additive Manufacturing，AM)，是一種新興的快速成型技術。它是在計算機的控制下，以物體的計算機輔助設計(CAD) 模型或者計算機斷層掃描(CT) 等數字模型文件為基礎，通過分層加工、逐層疊加材料(包括液體、粉材、線材或塊材等)的方式來構造任意形狀的3D物體的技術。

圖2 三維生物打印示意圖

三維打印于20世紀90年代由美國麻省理工學院(MIT)首次發(fā)明，被認為是制造領域的一次重大突破，也被眾多行內人士和國內外媒體譽為“第三次工業(yè)革命重要生產工具”。三維打印常用在模具制造、工業(yè)設計等領域，現在不僅用于傳統(tǒng)制造領域，而且還被成功地運用到了醫(yī)學與生物醫(yī)學工程中[12-16]。目前，三維打印設備和可供三維打印的材料不能滿足三維打印的需求，尤其是可供三維打印的材料。三維打印技術所用的材料主要是經過特殊處理的粘合劑和高分子材料，并且要求材料有很好的固化反應速度。作為可用于三維打印的材料，要求可以快速并且精確地成型，不同的三維打印技術有著各自對于材料的要求，可以說可供三維打印的材料的研發(fā)，極大地影響了三維打印技術的發(fā)展[12]。現階段，應用廣泛的三維打印技術主要有：熔融沉積成型(Fused Deposition Modeling) 、光固化立體印刷(Stereo Lithography Apparatus )和粉末材料選擇性激光燒結(Selective Laser Sintering) 等[17]。

近年來，三維打印在機械設備、生活用品、生物醫(yī)用材料，甚至是活體器官等領域得到迅速發(fā)展。在生物醫(yī)學領域，三維打印技術已經應用于制造個性化組織工程支架、器官模型和假體植入物，還用于策劃和分析手術方案，甚至可以直接打印出組織和細胞等[16]。

3.2 三維生物打印的研究現狀

組織工程用于制備絲素多孔支架的傳統(tǒng)方法有：相分離/冷凍干燥法、制孔劑法、靜電紡絲法、氣體發(fā)泡法等[17]。然而，這些技術的缺點包括高毒性的有機溶劑的大量使用，制備期間太長，過程勞動過于密集，在聚合物基體中的殘余顆粒的不能完全去除，重復性差，孔的形狀不規(guī)則，孔隙以及薄壁結構的互通不充足，此外，大多數這些方法對形狀控制有限制[18]。三維打印法(快速成型)是制備三維支架的一種新方法，是利用計算機輔助軟件來設計和制造各種形狀的三維支架，可以精確控制支架的孔徑大小和分布，成型時間短，適合自動化大規(guī)模生產，使用方便、易消毒，對溶液表面影響小，具有其它方法沒有的優(yōu)點[19]。

Skander Limem等[20]將0.6%的絲素水溶液噴墨打印在聚乙烯塑料基底上，然后在打印出來的絲素線上種植人體骨髓干細胞，在100ng/mL的BMP-2存在的條件下培養(yǎng)，一周后細胞開始生長并粘附在絲素線上。Sourabh Ghosh等[21]將絲蛋白通過一個安裝在三軸計算機控制平臺上的微細噴嘴沉積到富含甲醇的儲液器中，以使得沉積的纖維通過誘導結晶進行快速凝固，通過實驗證明直寫組裝的三維絲素蛋白支架支持人類骨髓間充質干細胞(hMSC)的粘附和增長，在這些支持支架上軟骨細胞條件下培養(yǎng)的細胞與標準微球培養(yǎng)相比，由于增加的糖胺聚糖的產量，所以提高了軟骨細胞的分化，三維絲素蛋白支架由于其支架結構的精確控制及其生物相容性，可能會在組織工程構建上有潛在的應用。Lin Sun，Sara T.Parker等[22]將絲素與羥基磷灰石混合，利用直寫組裝打印出三維支架，這種方法可以對于打印出的支架中的長纖維的大小和位置做出精確控制，然后將hMSCs和hMMECs混合培養(yǎng)在這些三維支架上，hMSCs和hMMECs在絲素和羥基磷灰石的三維支架上的細胞外基質形成了錯綜復雜的網絡。

盡管絲素蛋白擁有許多優(yōu)異的性能，不過和很多人工合成高聚物相比，未經處理的絲素蛋白支架因其結晶度低，導致強度低、易破碎等缺陷，而且絲素蛋白溶液品質受到原料質量影響。為了改善絲素蛋白的結構和特性以得到理想的組織工程支架材料，可以通過對絲素的理化性能進行改進或者與其他多聚物復合來得到，絲素蛋白主要與殼聚糖、硅酸鈣、羥基磷灰石、明膠、膠原蛋白、聚己內酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物等材料復合來制備組織工程支架[2,17]。Li Mingzhong等通過絲蛋白和明膠共混，制備一種斷裂伸長和彈性模量等性能均比純絲素蛋白溶液制成的膜性能都好的膜[23-24]。Yin Lihua等[25]用冷凍干燥技術制備絲素明膠三維支架，發(fā)現明膠的加入有利于穩(wěn)定支架的結構以及提高支架的熱穩(wěn)定性。

4 前景和展望

利用三維打印制備生物支架與運用傳統(tǒng)方法制備生物支架相比，存在可以控制支架的形狀和結構，從而使其滿足不同領域的應用要求的優(yōu)勢；絲素和明膠都有很好的生物相容性，且明膠的加入可以改善絲蛋白的凝膠成型性，是很好的生物支架材料。三維打印制備絲素蛋白基支架結合了三維打印和明膠與絲蛋白混合兩者的優(yōu)點，產品存在潛在的應用前景。

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