張玫瑩，朱鐵年，趙瑞景，崔玉潔，范 婧

惡性黑色素瘤是起源于胚胎期神經嵴的惡性腫瘤，惡性程度高，預后較差，發(fā)病率為全部惡性腫瘤的1%～3%，且呈上升趨勢。手術、放療、化療一直是惡性黑色素瘤治療的主要方法，但其對于放療和化療并不敏感。近年來，隨著黑色素瘤相關突變基因的發(fā)現(xiàn)與深入研究，分子靶向藥物為其治療帶來了新的希望。因此，探索更多的有效靶點成為治療的關鍵。表皮生長因子(epidermal growth factor， EGF)和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor， EGFR)可參與正常細胞和異常細胞的增殖、遷移和存活。目前有研究證明，在人類多種腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)EGFR過表達現(xiàn)象，且EGFR的表達水平與治療效果差、疾病惡化快及存活率低有關[1-4]。小凹蛋白-1(caveolin-1, Cav-1)是分子量為21～24 KDa的膜內在蛋白，是膜內陷囊泡的重要標志性結構蛋白。Cav-1由178個氨基酸殘基組成，位于肽鏈中的疏水殘基(102-134)在膜結構上形成特殊的發(fā)卡樣結構，將Cav-1蛋白分成N端及C端兩個區(qū)域，其中N端為主要的功能區(qū)域，該區(qū)域通過與EGFR相連接，從而調控EGFR酪氨酸激酶的活性。研究顯示Cav-1可在膀胱癌等細胞系中發(fā)揮抗腫瘤作用[5]，而其通過調控EGFR在惡性黑色素瘤細胞中發(fā)揮作用的研究尚未見報道。本研究以惡性黑色素瘤M2細胞為研究對象，旨在探討過表達Cav-1后對M2細胞生物學行為的影響，并進一步探討其可能的作用機制及影響的信號通路，為惡性黑色素瘤的治療提供理論基礎?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞來源：惡性黑色素瘤M2細胞系由美國國立衛(wèi)生研究院老年病研究所Michel Bernier教授惠贈。

1.1.2試劑：Cav-1質粒、pcDNA3.1陰性對照質粒(本實驗室保存)；G418(美國Amresco公司)；MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(以色列BI公司)；Human EGF(美國Sigma公司)；MTS(美國Promega公司)；p-EGFR、Akt、p-Akt單克隆抗體(美國Cell Signaling technology公司)、EGFR、Cav-1、β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG(美國Proteintech Group公司)；ECL超敏發(fā)光液(碧云天生物技術公司)。

1.1.3儀器：CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；低溫高速離心機(美國Thermo公司)；酶標儀(美國Thermo公司)；超低溫冰箱(美國Thermo公司)；24孔Transwell小室、96、24、6孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)：惡性黑色素瘤M2細胞用含10% FBS的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2、飽和濕度無菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細胞進行進一步實驗。

1.2.2質粒轉染：培養(yǎng)低表達Cav-1的M2細胞至60%～80%融合，分別轉染pcDNA3.1陰性對照質粒和Cav-1質粒。48 h后加入G418進行抗性篩選。蛋白免疫印跡(Western blot)法驗證Cav-1表達情況。

1.2.3MTS檢測細胞增殖情況：培養(yǎng)M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)細胞，無胎牛血清培養(yǎng)基饑餓4 h，分別加入濃度為0、4、20和100 nmol/L的EGF溶液，培養(yǎng)44 h，棄去舊培養(yǎng)基，按MTS 20 μl/孔與MEM培養(yǎng)液100 μl/孔混勻，每孔加入120 μl，避光操作。酶標儀上檢測490 nm波長處各孔的吸光度(OD值)。記錄并分析數(shù)據。此實驗重復3次。

1.2.4細胞劃痕實驗檢測細胞劃痕治愈率：培養(yǎng)M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)細胞，無胎牛血清培基饑餓4 h，以20 nmol/L EGF刺激。每5小時用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合情況，并拍照，直至其愈合。使用測量軟件分別測量各組細胞各個時間點劃痕愈合的寬度，并以起始寬度為1，計算其他各時間點劃痕相對寬度值，統(tǒng)計分析結果。此實驗重復3次。

1.2.5Transwell小室遷移實驗檢測細胞遷移能力：制備基質膠工作液，均勻鋪于Transwell小室濾膜上層底部，將處于對數(shù)生長期的M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)細胞接種于Transwell小室上室，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，擦除濾膜上層基質膠，95%乙醇固定30 min，常規(guī)HE染色。光鏡拍照，統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)，以M2(pcDNA3.1)細胞的穿膜細胞數(shù)為1，計算各組細胞的穿膜細胞相對值，統(tǒng)計分析結果。此實驗重復3次。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達水平：培養(yǎng)M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)細胞，終濃度為20 nmol/L EGF無血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)0、5、10、30 min。提取各組總蛋白，煮沸變性。將蛋白樣品等體積上樣，在8%分離膠及5%濃縮膠中進行電泳，在轉膜緩沖液中將膠上的蛋白轉印到PVDF膜上。孵育抗體，分別檢測M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)細胞中EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK、Cav-1和β-actin的蛋白表達水平，測量灰度值，分別計算各組細胞p-EGFR、p-Akt和p-ERK占總EGFR、Akt和ERK的相對值，統(tǒng)計結果并分析。此實驗重復3次。

2 結果

2.1穩(wěn)定轉染細胞株中Cav-1蛋白的表達水平 M2、M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)細胞中Cav-1表達量的相對灰度值分別是1.00、0.83±0.08和2.01±0.21。與M2和M2(pcDNA3.1)相比，M2(Cav-1)質粒轉染組細胞Cav-1蛋白表達明顯增高(P<0.01)。見圖1。

圖1 過表達Cav-1 M2細胞系的構建

2.2過表達Cav-1對M2細胞增殖的影響 在終濃度分別為0、4、20、100 nmol/L EGF刺激下，M2(pcDNA3.1)細胞增殖能力分別為0.92±0.03、1.03±0.11、1.10±0.10、1.22±0.09，M2(Cav-1)細胞增殖能力分別為0.63±0.05、0.73±0.06、0.80±0.02、0.89±0.03。M2(Cav-1)細胞增殖能力低于M2(pcDNA3.1)細胞(P<0.01)。

2.3過表達Cav-1對M2細胞遷移的影響 在無EGF刺激條件下，5、10、15 h均可見M2(Cav-1)細胞劃痕愈合速度較慢，其劃痕愈合的相對寬度值分別為0.92±0.03、0.81±0.05、0.65±0.01，M2(pcDNA3.1)細胞劃痕愈合的相對寬度值分別為0.72±0.02、0.57±0.03、0.34±0.04。M2(Cav-1)細胞劃痕愈合的相對寬度值大于M2(pcDNA3.1)細胞(P<0.01)。當存在EGF刺激條件下，M2(Cav-1)細胞在5、10、15 h劃痕愈合速度同樣慢于M2(pcDNA3.1)細胞，M2(Cav-1)細胞劃痕相對寬度分別為0.82±0.03、0.73±0.02、0.46±0.03，M2(pcDNA3.1)細胞分別為0.63±0.03、0.42±0.02、0。M2(Cav-1)細胞劃痕相對寬度大于M2(pcDNA3.1)細胞(P<0.01)。見圖2。

2.4過表達Cav-1對M2細胞侵襲的影響 M2(pcDNA3.1)細胞穿過Transwell小室濾膜的細胞相對值為1.00，M2(Cav-1)細胞為0.59±0.08。與M2(pcDNA3.1)細胞相比，M2(Cav-1)細胞侵襲能力減弱(P<0.01)。見圖3。

圖2 不同時點Cav-1對M2細胞遷移能力的影響(×100)

2.5過表達Cav-1 在M2細胞中對配體誘導的EGFR信號通路的影響 選取M2(pcDNA3.1)細胞和M2(Cav-1)細胞，采用Western blot檢測EGF刺激5、10、30 min后p-EGFR、p-Akt以及p-ERK水平。分別提取M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)細胞總蛋白，用Cav-1抗體檢測證實M2(Cav-1)細胞中Cav-1表達量明顯升高，為進一步分析Cav-1在EGFR信號通路中的作用提供依據。分別用抗磷酸化EGFR、Akt及ERK抗體檢測M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)細胞總蛋白。見圖4。在有EGF刺激的條件下，M2(Cav-1)細胞5、10、30 min磷酸化EGFR、Akt和ERK相對值均明顯低于M2(pcDNA3.1)細胞(P<0.01)。見表1。

圖3Cav-1對M2細胞侵襲能力的影響(HE×200)

3 討論

Cav-1作為一種多功能跨膜支架蛋白，存在于多種細胞類型中，參與細胞吞飲、膽固醇轉運、細胞膜組裝、信號跨膜轉導等細胞生命活動[6-7]。其中，Cav-1涉及細胞惡性轉化等方面的生物學行為，一直備受關注[8-10]。目前已有研究表明，腫瘤的增殖與遷移可由細胞內Cav-1表達量的下降引起。同時，Cav-1的缺失有可能影響其作為抑癌因子發(fā)揮作用時調控的信號通路[11]。在多種腫瘤中，如乳腺癌[12]、子宮頸癌[13]、胃癌[14-15]等均可發(fā)現(xiàn)，Cav-1表達量較正常組織明顯下調，被認為有抑制腫瘤發(fā)展和轉移的作用，是一種潛在抑癌基因。但在有關前列腺癌的研究中卻發(fā)現(xiàn)，Cav-1可以促進細胞的增殖、侵襲與轉移[16-17]。由此可見，Cav-1在不同組織腫瘤中的表達存在較大的差異，既可促進腫瘤的生長，又可抑制其發(fā)生、發(fā)展。然而，有關Cav-1在惡性黑色素瘤中的具體作用尚未得到明確闡述。

Cav-1基因位于D7S522和D7S2460的中間，定位于7q31.1。在許多人類惡性腫瘤中，Cav-1基因經常在7號染色體的這個位點發(fā)生突變或缺失。國內大量研究認為CSD介導了Cav-1的腫瘤抑制作用，而Cav-1的促進腫瘤發(fā)生作用可能與生長因子誘導Cav-1的酪氨酸和絲氨酸磷酸化以及膽固醇結合到Cav-1基因啟動子上引起的Cav-1表達上調有關。本實驗通過質粒轉染技術建立了過表達Cav-1的惡性黑色素瘤M2細胞株，并進行了MTS、劃痕愈合、Transwell等試驗，結果顯示過表達Cav-1可使細胞增殖、遷移、侵襲能力下降。

圖4惡性黑色素瘤細胞中過表達Cav-1對磷酸化EGFR、Akt、ERK活化水平的影響

表1 惡性黑色素瘤細胞中過表達Cav-1對磷酸化EGFR、Akt、ERK表達水平的影響

注：與對照組比較，bP<0.01

有研究證明，腫瘤細胞侵襲轉移的各個階段均與腫瘤細胞的跨膜機制密切相關，特別是通過影響EGFR及其下游的信號傳遞發(fā)揮調控作用。EGFR是細胞膜表面的糖蛋白受體，屬于ErbB受體家族，是酪氨酸受體家族的成員之一，有配體結合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)3個部分。胞內區(qū)的受體酪氨酸激酶(receptor tyrosinekinase， RTK)系統(tǒng)是其發(fā)揮作用的主要部位[18]。EGFR在未激活時是以單體形式存在的，而當其與配體結合后，即可形成同源、異源二聚體，從而激活RTK，提高了受體胞內區(qū)酪氨酸殘基的自身磷酸化水平，進一步激活下游信號通路。其下游信號主要包括MAPK/ERK、PI3K/AKT、STAT3等通路。其中，MAPK/ERK、PI3K/Akt信號轉導通路是細胞內兩條重要的存活及抗凋亡信號通路。Zhang等[19]研究認為，EGFR的表達與惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)過表達Cav-1可使惡性黑色素瘤M2細胞中的p-EGFR、p-ERK以及p-Akt蛋白水平明顯下降。提示Cav-1可能通過抑制MAPK/ERK、PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，本實驗通過分析Cav-1與EGFR及其信號通路分子之間的關系，進一步闡明了Cav-1在惡性黑色素瘤中的作用機制。實驗結果顯示Cav-1可能通過抑制MAPK/ERK、PI3K/Akt信號通路影響惡性黑色素瘤細胞M2的生物學行為。說明Cav-1可能成為惡性黑色素瘤治療的潛在靶點，而其具體機制有待于進一步研究。

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