劉 爽，邵 茜，牛群麗，安 杰，張 文，劉明亮

乳腺癌隨發(fā)病率及病死率的逐漸升高，成為威脅全球女性健康的最常見惡性腫瘤之一[1-3]。B細(xì)胞淋巴因子9(B-cell-CLL/lymphoma 9, Bcl-9)基因定位于人染色體1q21，易發(fā)生染色體(1;14)、(q21;q23)轉(zhuǎn)位[4]，并發(fā)現(xiàn)Bcl-9是Wnt信號(hào)通路中新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)癌基因，其異常表達(dá)是促使Wnt信號(hào)通路異常激活導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的新機(jī)制。Wnt信號(hào)通路異常與腫瘤發(fā)生的關(guān)系一直是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)，這條通路包含多種信號(hào)成員蛋白，眾多生命活動(dòng)均受其調(diào)節(jié)控制。該信號(hào)通路主要參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡與抗凋亡等生命過程，其異常激活與細(xì)胞單克隆性無限制惡性生長及癌變密切相關(guān)。Bcl-9在急性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)直腸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌及非吸煙患者肺腺癌等多種腫瘤組織中均存在異常表達(dá)[4-7]。但是Bcl-9在乳腺癌中的表達(dá)情況、參與發(fā)病進(jìn)程及其與臨床預(yù)后的關(guān)系，目前尚不清楚。因此本研究以3種不同表型的人乳腺癌細(xì)胞株為研究對(duì)象，通過檢測(cè)Bcl-9基因在人不同乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平，篩選出高表達(dá)Bcl-9的細(xì)胞株，并對(duì)其進(jìn)行基因敲除實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)基因敲除目的細(xì)胞株的生物學(xué)行為侵襲、遷移能力的研究，進(jìn)一步探討B(tài)cl-9在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系來源：人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株、MCF-7細(xì)胞株和MDA-MB-453細(xì)胞株均由白求恩國際和平醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，并在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、傳代。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：蛋白垂直電泳儀及槽式濕式轉(zhuǎn)膜器(伯樂Bio-Rad公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀(Themo)；RPMI 1640(美國Gibco公司)；胎牛血清(Serapro公司)；RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme公司)；蛋白提取試劑盒(北京普利萊公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶公司)；兔抗人多克隆抗體Bcl-9抗體(ABclonal公司)；慢病毒Bcl-9 shRNA質(zhì)粒包裝(上海吉滿生物)；Transwell細(xì)胞小室(Millipore，USA)；Matrigel膠(大鼠ESH肉瘤細(xì)胞外基質(zhì)提取物，BD公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-453均用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3RT-PCR檢測(cè)Bcl-9中mRNA的表達(dá) 使用RNA提取液提取細(xì)胞的總RNA，利用Vazyme試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以適量反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，采用熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Bcl-9 mRNA含量。BCL-9：上游引物：5'-ACTCCCGAGCAGATAGCG-3'，下游引物：5'-AGGTGCCCAGCCTTCACT-3'；GAPDH：上游引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',下游引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。將所得的Ct值轉(zhuǎn)換為2-△△Ct方法計(jì)算該目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量?！鳌鰿t=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。

1.4蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)Bcl-9轉(zhuǎn)錄蛋白表達(dá)水平 采用普利萊蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行總蛋白定量，SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉搖床封閉1 h。加入兔抗人Bcl-9多克隆抗體(1∶1000)以及鼠抗人β-actin抗體(1∶5000)，4℃過夜，二抗室溫?fù)u床孵育，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。以β-actin作為內(nèi)參蛋白。Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度分析，將目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶的灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及Bcl-9基因敲除實(shí)驗(yàn) 慢病毒shRNA質(zhì)粒由上海吉滿生物科技公司進(jìn)行包裝；將慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231，實(shí)驗(yàn)分為3組：A組為實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染沉默Bcl-9的shRNA)、B組為陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無義對(duì)照組)和C組為空白對(duì)照組(無轉(zhuǎn)染試劑)；轉(zhuǎn)染前1 d對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞常規(guī)消化，制備細(xì)胞懸液，進(jìn)行反復(fù)細(xì)胞計(jì)數(shù)，鋪24孔培養(yǎng)板，第2天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，12～24 h換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24～48 h后于倒置熒光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)變化情況，并采用RT-PCR及Western blot法檢測(cè)3組中Bcl-9基因的沉默情況。

1.6Transwell細(xì)胞小室實(shí)驗(yàn) 常規(guī)消化收集轉(zhuǎn)染72 h后的3組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液(無胎牛血清)，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行反復(fù)細(xì)胞計(jì)數(shù)，在Transwell上室提前用Matrigel膠包被后于上室加入無胎牛血清細(xì)胞懸液100～200 μl，下室中加入含10% FBS(胎牛血清)1640細(xì)胞培養(yǎng)液500～600 μl，在37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～48 h，取出細(xì)胞小室在無水甲醇中固定20 min，用含0.1%～0.2%的結(jié)晶紫染色15～20 min，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，分別取上、下、左、右和中5個(gè)高倍鏡視野來計(jì)數(shù)，計(jì)算5個(gè)視野的平均穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn) 常規(guī)消化收集轉(zhuǎn)染72 h后的3組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液(低胎牛血清)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板反復(fù)計(jì)數(shù)后鋪6孔板，第2天使用10 μl無菌槍頭垂直于細(xì)胞表面劃線，無菌PBS小心沖洗劃下的細(xì)胞2或3次，分別于0、12、24和48 h在倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并照相，用Image J軟件測(cè)量劃痕區(qū)域的像素，并定量分析細(xì)胞遷移的速度。采用細(xì)胞劃痕愈合率來進(jìn)一步比較細(xì)胞的遷移能力：細(xì)胞劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2 結(jié)果

2.1人乳腺癌細(xì)胞株中Bcl-9 mRNA及蛋白的表達(dá)水平 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞中Bcl-9 mRNA表達(dá)水平分別為0.016±0.004、0.008±0.002和0.004±0.002，Bcl-9蛋白表達(dá)水平分別為0.629±0.101、0.397±0.196和0.204±0.990。MDA-MB-231 Bcl-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于MCF-7和MDA-MB-453，且MCF-7高于MDA-MB-453(P<0.05)。見圖1。

圖1 3種乳腺癌細(xì)胞株中Bcl-9 mRNA和蛋白的表達(dá)情況

2.2慢病毒載體構(gòu)建及Bcl-9基因敲除實(shí)驗(yàn) 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組Bcl-9 mRNA表達(dá)水平分別為0.022±0.001、0.018±0.000和0.008±0.002,Bcl-9蛋白表達(dá)水平分別為0.402±0.032、0.368±0.052和0.002±0.001?？瞻讓?duì)照組和陰性對(duì)照組Bcl-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。見圖2。

圖2 3組乳腺癌細(xì)胞株Bcl-9蛋白表達(dá)表達(dá)情況

2.3體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組MDA-MB-231穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(151.50±7.580)、(417.00±5.310)和(420.50±3.704)個(gè)。實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05),陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.4細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞劃痕損傷24 h后劃痕愈合率分別為(0.382±0.012)%、(0.712±0.127)%和(0.709±0.015)%。實(shí)驗(yàn)組劃痕愈合率低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。倒置顯微鏡下細(xì)胞0 h與24 h細(xì)胞劃痕愈合情況,見圖4。

圖4 3組MDA-MB-231細(xì)胞株細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

3 討論

Wnt信號(hào)通路的失調(diào)與腫瘤發(fā)生的關(guān)系一直是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)，這條通路包含有多種信號(hào)成員蛋白，Bcl-9作為Wnt信號(hào)通路中新發(fā)現(xiàn)的核內(nèi)基因，其在多種Wnt信號(hào)通路失調(diào)中的異常表達(dá)表明其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路嚴(yán)格控制不同環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄過程，對(duì)維持組織細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。該通路的異常激活可導(dǎo)致腫瘤等相關(guān)疾病的發(fā)生，其中心效應(yīng)器是β-catenin[8]。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路是目前研究較多的Wnt信號(hào)通路之一，其在生物進(jìn)化過程中呈高度保守，并且參與調(diào)控眾多生命活動(dòng)過程。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活與細(xì)胞單克隆無限制惡性生長及癌變關(guān)系密切。Wnt信號(hào)使β-catenin在胞質(zhì)中穩(wěn)定并向核內(nèi)集聚，與細(xì)胞核內(nèi)TCF/LEF、Bcl-9/Bcl-9L和Py-gopus結(jié)合，形成TCF/LEF-β-catenin-Bcl-9-PYGO結(jié)構(gòu)復(fù)合物，該復(fù)合物是激活Wnt信號(hào)通路下游相關(guān)靶基因表達(dá)的關(guān)鍵，這些靶基因包括CD44、VEGF、c-Myc、CyclinD1、MMP-7、FGF20、DKK1、WISP1、MYC、CCND1、GCC等[5,7,9]。

乳腺癌是一種嚴(yán)重危害女性身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤之一[10-12]。而三陰性乳腺癌(triple-negtive breast cancer， TNBC)是雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人類表皮生長因子受體-2(Her-2)均無表達(dá)的乳腺癌亞型[13-15]，其具有獨(dú)特的生物學(xué)行為，侵襲性高，預(yù)后差，且目前尚無標(biāo)準(zhǔn)治療方案，其發(fā)病機(jī)制及治療成為研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)[16]。Bcl-9信號(hào)蛋白在經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的主要功能是作為銜接蛋白，在細(xì)胞核內(nèi)起連接Aramdillo/β-catenin和Pygo蛋白的作用，Bcl-9同源結(jié)構(gòu)域(HD)與PygoPHD指狀結(jié)構(gòu)、β-catenin前4個(gè)重復(fù)片段結(jié)合，形成TCF/LEF-β-catenin-Bcl-9-PYGO四聚體復(fù)合物；其次Bcl-9可促使與β-catenin結(jié)合的輔因子Pygo的作用并誘使β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)聚集并與之結(jié)合，從而進(jìn)一步促進(jìn)四聚體核復(fù)合物的形成，并激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，這在胚胎發(fā)育、干細(xì)胞生長及腫瘤形成過程中起著重要作用[8,17-21]。Bcl-9的同原產(chǎn)物Bcl-9-2除了作為β-catenin轉(zhuǎn)錄的輔助因子外，還可以影響β-catenin的細(xì)胞黏附和轉(zhuǎn)錄功能的發(fā)揮，這兩種功能的正常維持有助于機(jī)體的正常發(fā)育，否則導(dǎo)致腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移[4,22]。曾有文獻(xiàn)報(bào)道Bcl-9-2可以調(diào)節(jié)ER的表達(dá)，從而改善他莫西芬對(duì)乳腺癌的治療效果，并且Bcl-9高表達(dá)會(huì)促進(jìn)乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移[23]。

本研究初步在人乳腺癌細(xì)胞株中探索降低Bcl-9表達(dá)水平對(duì)乳腺癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。首先采用RT-PCR及Western blot法分析3種不同表型人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(ER-，PR-，Her-2-)、MCF-7(ER+，PR+，Her-2-)和MDA-MB-453(ER-，PR+，Her-2+)中，Bcl-9基因和蛋白表達(dá)水平篩選出表達(dá)水平較高的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株，而MDA-MB-231細(xì)胞株也是TNBC體外的典型代表，Bcl-9表達(dá)與關(guān)系可能更為密切。繼而針對(duì)Bcl-9基因設(shè)計(jì)shRNA慢病毒干擾序列，根據(jù)該序列合成干擾表達(dá)質(zhì)粒pGPH-shBcl-9。采用RNA干擾的方法下調(diào)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞中Bcl-9表達(dá)，利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析Bcl-9基因的下調(diào)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。本研究結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞株Bcl-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于MCF-7和MDA-MB-453，且MCF-7高于MDA-MB-453，提示3種乳腺癌細(xì)胞株中Bcl-9蛋白表達(dá)水平與基因表達(dá)水平一致，MDA-MB-231細(xì)胞株Bcl-9表達(dá)最高。本研究中實(shí)驗(yàn)組Bcl-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，MDA-MB-231穿膜細(xì)胞數(shù)低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，劃痕愈合率低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。提示RNA干擾可使Bcl-9表達(dá)下調(diào)，而下調(diào)Bcl-9表達(dá)后可抑制細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力。

綜上所述，Bcl-9對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力具有重要的影響，并且具有發(fā)展成為新型乳腺癌治療靶位的潛力，本研究結(jié)果為乳腺癌尋找新的治療靶點(diǎn)提供了有力的證據(jù)。

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