肖文波，黃會林，馮彥娜，曾春琴

卵巢癌是全球女性最常見的生殖系統(tǒng)腫瘤，每年將近有150萬新發(fā)病例，也是病死率最高的婦科腫瘤，2015年統(tǒng)計約50萬人死于卵巢癌[1-3]。在2016年，估計中國婦女將有30萬卵巢癌新發(fā)病例及近10萬死亡病例[4]。由于卵巢癌早期診斷困難，臨床癥狀及早期血清學指標不明顯，因此尋找有效的分子學診斷標志物對卵巢癌的診斷和預后有重要意義。miRNA是由22～24個核苷酸通過非編碼小RNA結(jié)合到3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)的靶向mRNA[5]。基于最新研究發(fā)現(xiàn)，已發(fā)現(xiàn)1881個miRNA前體和2588個成熟miRNA[6]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA可以在多種腫瘤中充當腫瘤抑制劑(如miR-34、miR-125、miR-200家族)，通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)控基因表達的作用[7-8]，而miRNA異常表達參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程和腫瘤細胞遷移、侵襲相關(guān)信號途徑的激活[9-10]。PAPD5是人細胞中非經(jīng)典聚合酶家族的7個成員之一。PAPD5在體內(nèi)是聚腺苷酸化的蛋白前體[11]。有研究報道，PAPD5參與組蛋白mRNA的尿苷酸化依賴性降解，可以影響腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移[12]。最近又有研究報道，PAPD5在肝癌組織中表達水平增高，可以激活相對靜止狀態(tài)的肝癌細胞進行快速擴增[13]。本研究探討miR-200和PAPD5在卵巢癌中的表達情況及二者對卵巢癌細胞遷移侵襲能力的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1組織樣本 收集2016年7月—2017年7月于湖北省宜城市人民醫(yī)院進行的卵巢癌切除手術(shù)的卵巢癌組織和癌旁正常卵巢組織各30例。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意。卵巢癌組織經(jīng)過組織病理學的證實。切除的腫瘤組織樣本立即放入液氮中冷凍并儲存在-80℃直至RNA提取。

1.2細胞株及相關(guān)材料 卵巢癌細胞株SKOV3、ES2、A2780均獲自武漢大學典型培養(yǎng)物保存中心。細胞培養(yǎng)條件：在RPMI 1640培養(yǎng)基中加入1%青霉素/鏈霉素。用5%胎牛血清在5% CO2空氣濕潤培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。兔克隆單抗PAPD5購于abcam公司(Sigam，F(xiàn)LJ40270)。miR-200-mimic和miR-200-inhibitor購自于上海吉瑪基因有限公司。SsoFast EvaGreen試劑及Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購于TAKARA公司。

1.3細胞轉(zhuǎn)染 設(shè)定MOI值為0、20、50、200，觀察熒光細胞表達的比例，選取熒光細胞比例最高且對細胞毒性最小的MOI值設(shè)定為最佳MOI值，測量得最佳值為50。調(diào)節(jié)細胞至對數(shù)生長狀態(tài)，細胞轉(zhuǎn)染前36 h接種于24孔板培養(yǎng)，第2天細胞密度達到50%～80%融合狀態(tài)。將病毒置冰上融解后，按最佳MOI值用培養(yǎng)液稀釋，加入終濃度為5 ng/ml的凝聚胺，輕輕混勻后加入到細胞中，將miR-200-mimics、miR-200-inhibitor和陰性對照組轉(zhuǎn)染細胞；按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將miR-200-mimics、miR-200-inhibitor和陰性對照轉(zhuǎn)染細胞。在培養(yǎng)箱中孵育12 h后換上完全培養(yǎng)基。

1.4qPCR檢測miR-200的表達 將A2780卵巢癌細胞接種于6孔板，接種密度為1×106個/L，培養(yǎng)36 h后按照Trizol說明操作提取細胞總RNA，使用紫外分光光度計檢測核酸濃度和純度。用在SsoFast EvaGreen試劑(Bio-Rad)中以1∶10稀釋的cDNA進行qPCR測量。將表達數(shù)據(jù)標準化至相應的參照基因。檢測基因反應條件為：37℃ 15 min，98℃ 5 min。后根據(jù)PCR試劑盒說明書進行PCR反應。以RQ=2-ΔΔCT計算mRNA表達量。

1.5蛋白免疫印跡分析 提取A2780卵巢癌細胞蛋白檢測PADA5的表達水平。配置SDS-PAGE電泳膠，取免疫沉淀最后所得的上清，上樣，每孔30 μl，電泳。用電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF或NC膜上。電轉(zhuǎn)移完畢后，用膜洗滌1次。將膜放入5%牛奶封閉液于室溫封閉1 h，或4℃封閉過夜。用封閉液稀釋目標蛋白抗體(PAPD5)1∶2000，室溫下孵育作用2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。稀釋酶標記二抗1∶500，室溫下孵育30 min。TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯影劑顯影，使用Image Lab 3.0(Bio-Rad)進行分析。實驗重復3次。

1.6Transwell侵襲實驗檢測miR-200對卵巢癌細胞侵襲能力的影響 所有試劑及器材均于冰上預冷，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，將Transwell小室內(nèi)膜均勻涂抹Matrigel膠50 μl(0.2 μg/μl)，37℃孵育15 min，凝固膠后；消化、離心、計數(shù)卵巢癌細胞后，按照2.5×104個/ml用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞，制成細胞懸液；按照每孔200 μl，將細胞懸液加入Transwell上室，同時在Transwell下室加入10%FBS+培養(yǎng)基600 μl，放入37℃孵箱培養(yǎng)；甲醛固定，結(jié)晶紫染色10 min，然后用棉簽輕輕擦拭內(nèi)膜上的細胞。顯微鏡下計數(shù)4個高倍視野(×40)下穿過濾膜的細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.7劃痕實驗檢測miR-200對卵巢癌細胞遷移能力的影響

1.7.1細胞接種：將細胞密度調(diào)整為5×105個/ml，接種到6孔板中，放置于5% CO2溫箱孵育過夜，使細胞融合度達到100%。

1.7.2細胞劃痕實驗：先用Marker筆在每個孔的背面做好標記，以保證獲取數(shù)據(jù)的位置保持一致。用滅過菌的槍頭比著直尺，垂直于標記線快速進行劃痕,并用PBS緩沖液反復沖洗細胞孔，將懸浮細胞去除,向培養(yǎng)孔加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基，放置于5% CO2的37℃孵箱孵育。

1.7.3拍照：按照試驗設(shè)計中的時間點取樣，在顯微鏡下拍照。測量劃痕的初始距離(0 h)；在24、48、72 h后分別測量劃痕的距離，并拍照，計算細胞遷移率。

2 結(jié)果

2.1miR-200在卵巢癌組織和不同卵巢癌細胞株中的表達 miR-200在卵巢癌組織和癌旁正常卵巢組織中的表達水平分別為8.12±0.98和3.06±0.46。miR-200在卵巢癌組織中的表達水平高于癌旁正常卵巢組織(P<0.05)。miR-200在A2780、ES2和SKOV3卵巢癌細胞株表達水平分別為7.93±0.96、4.93±0.62和1.36±0.26。miR-200在A2780卵巢癌細胞株中的表達水平高于ES2和SKOV3細胞株(P<0.05)。后續(xù)實驗選取A2780細胞株作為實驗對象。

2.2miR-200在A2780卵巢癌細胞株中調(diào)控PAPD5的表達 對照組PAPD5的蛋白水平為46.2±4.2，miR-200-mimic組和miR-200-inhibitor組培養(yǎng)50 h后分別為13.6±2.32和79.6±8.6。miR-200-mimic組PAPD5的蛋白水平低于對照組，miR-200-inhibitor組高于對照組(P<0.05)。見圖1。對照組A2780的細胞活性為72.4±5.6，miR-200-mimic組和miR-200-inhibitor組培養(yǎng)50 h后分別為88.6±9.5和64.5±7.6。miR-200-mimic組A2780的細胞活性高于對照組，miR-200-inhibitor組低于對照組(P<0.05)。

圖1 3組A2780卵巢癌細胞株P(guān)APD5蛋白的表達

2.3miR-20對A2780卵巢癌細胞株遷移能力的影響 對照組A2780卵巢癌細胞遷移率為(47.5±4.7)%，miR-200-mimic和miR-200-inhibitor組處理50 h后為(67.3±5.1)%和(22.6±3.2)%。miR-200-mimic組A2780卵巢癌細胞遷移率高于對照組，miR-200-inhibitor組低于對照組(P<0.05)。

2.4miR-200對A2780卵巢癌細胞株侵襲能力的影響 對照組、miR-200-mimic組和miR-200-inhibitor組穿膜細胞數(shù)分別為(111.3±9.6)、(175.6±16.3)和(63.5±8.4)個。miR-200-mimic組A2780卵巢癌細胞株中穿膜細胞數(shù)高于對照組，miR-200-inhibitor組低于對照組(P<0.05)。

3 討論

卵巢癌是一種由多種因素引起的女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[14-16]。由于診斷水平存在一定缺陷，早期卵巢癌的診斷尚未達到滿意的要求，對卵巢癌的治療和預后不利[17-18]。隨著分子生物學和生物檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，卵巢癌的分子標志物獲得越來越多的關(guān)注，檢測卵巢癌的臨床分子標記物，然后根據(jù)不同標記物的情況對卵巢癌患者采取個體化治療是未來發(fā)展的方向[19]。

最近有大量研究表明，miRNA在不同腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中可能扮演重要角色[20]。腫瘤相關(guān)miRNA及其下游相關(guān)靶向因子的相互作用與惡性腫瘤的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移有潛在的聯(lián)系[21]。因此，miRNA的研究可能為卵巢癌新型治療方案和預后提供理論支持。盲目的去探索mRNA及其下游相關(guān)靶點的相互聯(lián)系是耗時且昂貴的，我們應該選擇合適方法去預測篩選相關(guān)的分子層面的聯(lián)系。

使用生物信息學方法，我們預測miR-200可能在卵巢癌細胞增殖、侵襲、代謝和凋亡中起重要作用。據(jù)報道，miR-200在膀胱癌細胞中的高表達水平可以影響其病情進展，在人類肝癌細胞也存在高表達現(xiàn)象[22]。在后續(xù)驗證研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-200可以顯著促進卵巢癌細胞的遷移和侵襲的進展。然而，尚缺乏關(guān)于miR-200在卵巢癌中的轉(zhuǎn)移作用的具體機制。本研究結(jié)果顯示，miR-200在卵巢癌組織的表達水平高于癌旁正常卵巢組織，miR-200-mimic組A2780卵巢癌細胞遷移率和穿膜細胞數(shù)高于對照組，提示過表達miR-200后可以明顯促進細胞的遷移和侵襲，其可作為促癌基因促進卵巢癌的進展。另外，我們通過生物信息學方法預測PAPD5可能是miR-200的下游靶點。本研究結(jié)果顯示，miR-200-mimic組PAPD5的蛋白水平降低，A2780的細胞活性升高。推測miR-200有可能通過調(diào)控下游PAPD5來影響卵巢癌的生物學功能。后續(xù)實驗證明miR-200的表達水平可以調(diào)控卵巢癌細胞的侵襲和遷移，這與我們對miR-200功能預測是一致的。

綜上所述，我們通過研究miR-200與下游PADA5靶點相互作用對卵巢癌細胞的生物學行為的影響證實了我們的猜測，補充了miR-200在卵巢癌中的生物信息學機制。目前的研究表明miR-200對卵巢癌的遷移和侵襲是至關(guān)重要的，為miR-200對卵巢癌的臨床診斷和生物學治療提供了新的理論方法。

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