謝 鵬，薛 改，劉建芳

肝硬化是多種慢性肝病發(fā)展的晚期階段，病理方面以肝臟彌漫性纖維化、再生結(jié)節(jié)和假小葉形成為特征[1]。在全球范圍的年發(fā)病率為100/10萬，發(fā)病高峰年齡在35～50歲，合并并發(fā)癥時病死率高，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[2]。肝纖維化具有一定的可逆性，可以施加部分手段進(jìn)行干預(yù)，阻止其發(fā)展成肝硬化，同時防止肝纖維化也是防止肝癌的重要突破點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬在肝纖維化中出現(xiàn)增多，細(xì)胞自噬可以增強(qiáng)肝細(xì)胞活化和肝纖維化發(fā)生程度，且自噬可以通過降解脂滴為肝細(xì)胞活化提供能量[3]。有實(shí)驗(yàn)研究表明，抑制自噬可抑制肝細(xì)胞前膠原mRNA的表達(dá)及肝細(xì)胞株的增殖[4]。因此通過調(diào)節(jié)自噬水平可能成為防止肝纖維化的新靶點(diǎn)。最新研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可降低血清Ⅲ型前膠原、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白水平，延緩肝纖維化形成，且能夠抑制肝纖維化大鼠干細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制肝細(xì)胞激活，減少轉(zhuǎn)化生長因子-β1(RGF-β1)的分泌[5]。有報道川芎嗪對抑制、減輕肝纖維化有一定療效，但是川芎嗪對活化肝細(xì)胞株自噬作用是否有影響未見報道，因此本實(shí)驗(yàn)使用不同濃度的川芎嗪對活化肝細(xì)胞株HSC-T6進(jìn)行干預(yù)，利用MDC染色法結(jié)合熒光顯微鏡觀察肝細(xì)胞株HSC-T6中自噬溶酶體的形態(tài)改變，檢測肝細(xì)胞株HSC-T6中自噬信號蛋白的表達(dá)，研究其對肝細(xì)胞株HL7702自噬的影響，為將來篩選肝纖維化的中藥研究積累資料。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與主要試劑 正常大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6購自武漢大學(xué)細(xì)胞中心。細(xì)胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的RPMI 1640，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。胎牛血清，RPMI 1640培養(yǎng)基均購自HyClone公司。MDC試劑盒購于碧云天生物有限公司。ATG5、beclin1、LC3Ⅱ兔單克隆抗體均購自Abcam(ab108327、ab207612、ab51520)。

1.2平板克隆實(shí)驗(yàn) 使用常規(guī)培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞系HSC-T6經(jīng)胰酶消化后，1200 r/min，3 min，棄去上清液。加入5 ml的無菌PBS溶液，輕輕吹散洗滌細(xì)胞沉淀并再次離心。反復(fù)洗滌3次后加入培養(yǎng)基，制備成單細(xì)胞懸液。測定細(xì)胞濃度并調(diào)整為1000個/ml，將單細(xì)胞懸液均勻的種植在無菌6孔板內(nèi)，進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn)。2周后觀察平板克隆細(xì)胞形成情況。

1.3MDC染色 使用去離子水稀釋W(xué)ash buffer，1000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，使用Wash buffer洗滌細(xì)胞，介入適量的Wash buffer重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到1×106個/ml。取適量細(xì)胞懸液到新EP管中，加入MDC染色，輕輕混勻。室溫避光染色，離心收集細(xì)胞，清洗細(xì)胞2次，棄上清。滴加于載玻片，加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測自噬相關(guān)蛋白 在培養(yǎng)瓶中加入適量細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞蛋白，低溫保存待用。配制15% SDS-PAGE，樣品孔上樣25 μl，于80 V恒壓40 min，120 V恒壓60 min，使用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉封閉2 h于搖床上，一抗(ATG5，beclin1，LC3Ⅱ，濃度1∶2000)孵化，4℃過夜；二抗室溫孵育2 h；ECL發(fā)光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1不同濃度川芎嗪對肝星狀細(xì)胞系HSC-T6影響 不同濃度川芎嗪對肝星狀細(xì)胞系HSC-T6中ATG5蛋白影響水平不同，25 ng/ml是川芎嗪作用于肝星狀細(xì)胞系HSC-T6最佳濃度(圖1)。結(jié)合以上結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們采取25 ng/ml濃度進(jìn)行。

2.2川芎嗪對大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6增殖作用的影響 對照組平板克隆實(shí)驗(yàn)形成的細(xì)胞球數(shù)目為179.2±7.4，川芎嗪組為42.6±2.9。川芎嗪組平板克隆實(shí)驗(yàn)形成的細(xì)胞球數(shù)目少于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6中自噬溶酶體的形態(tài)改變 相對對照組，川芎嗪組大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6出現(xiàn)明顯的點(diǎn)狀聚集，亮度增加，自噬體降解數(shù)量明顯增加。見圖2。

圖1不同濃度川芎嗪對大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6自噬功能的影響

圖2川芎嗪對大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6自噬溶酶體的影響

2.4川芎嗪對自噬信號分子蛋白ATG5、beclin1、LC3Ⅱ表達(dá)的影響 加入25 ng/ml的川芎嗪后，大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6 ATG5、beclin1及LC3Ⅱ表達(dá)水平為(18.16±1.36) %、(82.94±5.93)%及(76.54±9.19)%，對照組表達(dá)水平分別為(86.12±3.42)%、(22.72±2.86)%和(16.43±3.8)%。川芎嗪組大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6 ATG5表達(dá)水平低于對照組，beclin1及LC3Ⅱ表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)。見圖3。

圖32組大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6中自噬蛋白的變化水平

3 討論

肝纖維化是慢性肝臟疾病導(dǎo)致的過度損傷修復(fù)的過程[6]。在這個過程中，肝細(xì)胞外基質(zhì)成分過多的沉積在肝內(nèi)引起肝纖維化[7]。肝臟損傷后導(dǎo)致位于肝竇狀隙內(nèi)的肝細(xì)胞活化并分化為肌成纖維細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞明顯增殖并分泌大量細(xì)胞活化因子及細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肝纖維化[8]。

自噬是通過自我清除體內(nèi)無用的累積蛋白質(zhì)聚集物和有缺陷的細(xì)胞器等，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[9]。在受到外界環(huán)境刺激，細(xì)胞通過提高自噬水平，將胞漿內(nèi)組分分解為游離氨基酸、脂肪酸和核苷酸，維持細(xì)胞能量代謝[10]。劉曼等[11]報道自噬和肝星狀細(xì)胞系HSC-T6活化有關(guān)。Salemi等[12]也發(fā)現(xiàn)在肝星狀細(xì)胞系HSC-T6活化過程中，代表自噬溶酶體的紅色斑點(diǎn)增加，說明自噬流量增加。乙型或丙型肝炎病毒利用自噬促進(jìn)病毒復(fù)制[13]。在酒精性肝損害中，抑制自噬水平有助于清除沉積的無功能大分子蛋白[14]。根據(jù)不同疾病自噬作用，通過調(diào)節(jié)自噬水平有助于疾病轉(zhuǎn)歸及預(yù)防肝纖維化形成。

川芎嗪具有抗血小板、使血小板解聚的作用，對心腦血管供血不足引起的各種癥狀有很好的緩解作用[15]。孫偉大等[16]發(fā)現(xiàn)川芎嗪能抑制肝纖維化大鼠細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制肝細(xì)胞株激活，從而改善肝纖維化。本實(shí)驗(yàn)通過檢測不同濃度川芎嗪對活化肝星狀細(xì)胞系HSC-T6的作用，篩選出活化肝星狀細(xì)胞系HSC-T6最佳濃度為25 ng/ml，然后通過MDC染色顯示肝星狀細(xì)胞系HSC-T6內(nèi)自噬溶酶體呈現(xiàn)膨脹狀態(tài)，有較多偽足，質(zhì)膜相對不完整，表明該濃度川芎嗪可促進(jìn)肝細(xì)胞自溶進(jìn)程，加速自噬溶酶體破解。本研究結(jié)果顯示，川芎嗪組平板克隆實(shí)驗(yàn)形成細(xì)胞球數(shù)目少于對照組，自噬體降解數(shù)量明顯增加，ATG5表達(dá)水平低于對照組，beclin1及LC3Ⅱ表達(dá)水平高于對照組。提示川芎嗪可抑制肝星狀細(xì)胞系HSC-T6增殖能力，加速自噬溶酶體降解過程，下調(diào)自噬蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，川芎嗪可以抑制肝細(xì)胞的增殖，還可影響其自噬溶酶體的形態(tài)變化，其可以干擾肝纖維化發(fā)展至肝硬化的進(jìn)程，有可能對肝纖維化的治療提供理論依據(jù)。

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