， ， ，，，，，鄧月

(四川省骨科醫(yī)院上肢科，四川 成都 610041)

Notch信號通路是高度保守的細胞間信號傳導(dǎo)通路，廣泛存在于無脊椎動物及脊椎動物中。Notch信號通路通過配體與受體結(jié)合激活，調(diào)控細胞的增殖、分化與凋亡，決定細胞的命運，與多種組織、器官、系統(tǒng)的發(fā)育及多種疾病密切相關(guān)[1-2]。目前證實哺乳動物有4個Notch受體(Notch1～4)和5個Notch配體(Delta1、Delta3、Delta4、Jagged-1、Jagged-2)。骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是最常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，具有較高的發(fā)病率。有文獻報道40歲以下人群的發(fā)病率約5%，60歲以上人群中高達50%的人在X射線上有OA表現(xiàn)，75歲以上人群中高達80%的人有OA癥狀[3-4]。OA晚期導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、畸形和功能障礙，嚴重影響患者的工作與日常生活，是成年人勞動力喪失的主要原因之一。我國骨關(guān)節(jié)炎患者可能超過5 000萬[4]。Notch信號通路在OA軟骨細胞增殖、分化、凋亡、基質(zhì)合成及維持軟骨細胞表型等方面起著十分重要的作用[1-2]。OA關(guān)節(jié)軟骨中異常表達的Notch信號通路與其他OA致病因子共同作用于OA軟骨及滑膜等組織，參與OA的整個病變過程[5-6]。但目前Notch配體及受體信號通路在OA中的作用地位及作用機制尚不明確，還需要進一步研究。

本文旨在通過細胞跨膜Notch配體4(delta-like ligand 4,DLL4)和γ-分泌酶抑制劑(DAPT)分別激活和抑制Notch信號通路后，觀察體外培養(yǎng)的OA軟骨細胞中Notch1、Notch3、Jagged-1、Jagged-2、HES5的表達情況，探索DLL與OA軟骨細胞基質(zhì)合成的關(guān)系及其可能的作用機制，從而探索Notch信號通路在骨關(guān)節(jié)炎病變進程中的作用及其可能的作用機制，為探索骨關(guān)節(jié)炎早期藥物治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2017年我院8例因膝關(guān)節(jié)OA行膝關(guān)節(jié)置換患者的股骨髁軟骨作為觀察組，再選擇1例因外傷行膝上截肢的正常股骨髁軟骨作為對照組。收集患者一般資料，根據(jù)病史、X射線片、術(shù)中肉眼觀察、術(shù)后鏡下病理學(xué)等排除標(biāo)本腫瘤、結(jié)核、感染、類風(fēng)濕炎癥、明顯骨質(zhì)疏松，同時排除有免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病等全身性疾病患者。觀察組8例，男2例，女6例，年齡57～85歲，平均68.1歲；左側(cè)5例，右側(cè)3例。對照組1例，男性，19歲。觀察組及對照組取適量軟骨組織塊放入4%多聚甲醛固定，剩余部分放入DMEM低糖培養(yǎng)基等待細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)液為無菌的DMEM低糖培養(yǎng)基(鏈霉素100 u/mL,青霉素100 u/mL)。細胞培養(yǎng)用100 ng/μL DLL4和20 μmol/L DAPT分別激活和抑制OA軟骨細胞Notch信號通路，使用OA軟骨細胞+PBS緩沖液作為對照。

1.2 細胞培養(yǎng)

1.2.1 原代培養(yǎng) 取剩余新鮮的軟骨組織先后使用0.2%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型膠原酶低糖DMEM溶液、0.2%Ⅱ型膠原酶(sigma)溶液消化，再加入DMEM培養(yǎng)基(含20%胎牛血清，鏈霉素100 u/mL,青霉素100 u/mL)制成細胞懸液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，再置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般4～6 h后軟骨組織塊消化完全。觀察細胞生長情況，每3 d換液。

1.2.2 傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)細胞覆蓋瓶底80%以上時，吸盡培養(yǎng)基，PBS清洗2次后加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃、5%CO2孵育箱消化2～3 min，鏡下觀察待大部分細胞變圓漂浮時，加入20%含胎牛培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心3 min后加入適量20%胎牛DMEM培養(yǎng)基重懸，血球計數(shù)板計數(shù)，104/mL傳代接種進入傳代培養(yǎng)。同時進行細胞爬片，Ⅱ型膠原免疫組化染色行細胞鑒定。

1.2.3 細胞爬片 蓋玻片放置于培養(yǎng)皿中，無菌0.1 mg/mL多聚賴氨酸溶液包被蓋玻片后干燥備用，待1代軟骨細胞爬滿培養(yǎng)瓶80%時，消化收集細胞，所收集的細胞按104～105/mL接種，隔夜待細胞貼壁后按分組加入實驗藥物，觀察細胞生長情況，培養(yǎng)5 d后終止培養(yǎng)待細胞學(xué)檢測。分組情況如下：①正常組(正常軟骨細胞)；②OA組(OA軟骨細胞+PBS緩沖液)；③DAPT組(OA軟骨細胞+DAPT 20 μmol/L)；④DLL4組(OA軟骨細胞+DLL4(DLL4)100 ng/μL)。

1.3 組織學(xué)檢測

取材后軟骨組織用4%多聚甲醛固定24 h后乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)脫鈣，石蠟包埋后4 μm切片待組織學(xué)檢查。分別使用HE染色、甲苯胺藍染色觀察軟骨的形態(tài)變化。

1.4 免疫組化

免疫組化檢測Notch-1、Jagged-1、Jagged-2、HES5、Notch-3在正常軟骨細胞及OA軟骨細胞中的表達情況。待1代細胞爬滿培養(yǎng)瓶80%后，消化收集細胞，收集的細胞按104～105/mL接種于6孔板的蓋玻片上，隔夜待細胞貼壁后按分組加入實驗藥物，培養(yǎng)5 d后終止培養(yǎng)，待下一步細胞學(xué)檢測。實驗步驟：培養(yǎng)5 d終止細胞培養(yǎng)，PBS清洗5 min，3次；4%多聚甲醛固定30 min；PBS清洗5 min，3次；3%H2O2(試劑A)孵育10 min；PBS清洗標(biāo)本5 min，3次；山羊血清孵育(試劑B)37 ℃，30 min；相應(yīng)的一抗孵育(滴度1∶200)4 ℃過夜，陰性對照滴加等量的PBS；PBS清洗5 min，3次；二抗工作液孵育37 ℃，30 min；PBS清洗5 min，3次；滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液孵育30 min；PBS清洗5 min，3次；DAB顯色，3～10 min；自來水沖洗；蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡觀察、讀片，記錄實驗結(jié)果。

1.5 Western blot蛋白印記技術(shù)

細胞培養(yǎng)及實驗處理：OA軟骨細胞培養(yǎng)瓶棄培養(yǎng)基，漂洗細胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。加入1X SDS樣品緩沖液(每孔100 μL，每瓶500～1 000 μL)，刮落細胞，轉(zhuǎn)移到Ep管；蛋白裂解溶液的配制：Laemmli樣品緩沖液950 μL，加入2-硫基乙醇50 μL，混勻；蛋白裂解：取收集的細胞，每 1X 細胞加入100 μL蛋白裂解液，反復(fù)吹打，使細胞充分裂解，樣本經(jīng)100金屬浴變性，高速離心，-20 ℃保存。Western blot聚丙烯酰胺凝膠電泳：安裝配好膠配制，定好分離膠位置，配制分離膠(12%)、濃縮膠，將已準備好的蛋白樣品置于100金屬浴中煮沸變形5 min，高速離心，備用。將配置好的膠放入電泳槽里，拔去梳子，加入電泳緩沖液，使之沒過膠，用加樣器吸取10 μL樣品緩慢加入泳道，其中一空加預(yù)染的蛋白分子量Marker。將電泳裝置與電源相連，恒壓80 V 30 min，恒壓110 V。蛋白膜轉(zhuǎn)移：取出凝膠，去除濃縮膠成分，置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，輕輕晃5 min，剪下與凝膠相同大小的PVDF膜，按梳子的齒列順序用鉛筆輕輕標(biāo)記好泳道，甲醇中浸沒10 s，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中輕輕搖晃10 min。去除電泳轉(zhuǎn)移夾，按陰極(黑色)、海綿墊、濾紙(3～4層)、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿墊、陽極(紅色)的順序做好,注意PVDF膜上的序號應(yīng)與膠的泳道相對應(yīng)，凝膠和PVDF膜之間不要有氣泡。放置好后置于轉(zhuǎn)移槽中，加入足量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，使其完全浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，并在轉(zhuǎn)移槽的四周用碎冰覆蓋，接上電源，恒流240 mA,2.5 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，去除PDVF膜，TBS溶液洗3次(每次5 min)，凝膠可用考馬斯亮藍染色30 min，然后清水浸泡，觀測轉(zhuǎn)膜的效率。免疫雜交：將洗好的PDVF膜置于塑料盒中，加入適量的5%脫脂牛奶，置于搖床輕輕搖晃2 h。倒去封閉液，用TBS/T溶液洗3次(每次10 min)將膜置于封口袋，注意此過程戴手套，且盡量不用手接觸PDVF膜，加入牛奶稀釋的(濃度1∶1 000)的一抗，封口后置于搖床上室溫緩慢搖晃孵育4～6 h或置于4 ℃過夜。將PDVF膜置于塑料盒中，TBS/T溶液洗3次，10 min。將膜置于封口袋，加入牛奶稀釋的(濃度1∶5 000)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(山羊抗兔)，室溫緩慢搖晃2 h。將PDVF膜置于塑料盒中，用TBS/T溶液洗3次(每次10 min)?；瘜W(xué)發(fā)光法顯帶：配制ECL顯色液配制，將顯色液均勻地滴在PVDF膜上，使顯色液與膜充分反應(yīng)。將PVDF膜置于Bio-Rad凝膠成像儀成像。

1.6 評價方法

免疫組化結(jié)果評價方法：觀察細胞染色強度A及陽性細胞率B。染色強度A得分方法：0(陰性)，1(弱陽性，輕度黃色，棕黃色顆粒)，2(中度陽性，棕黃色顆粒)，3(強陽性，棕褐色)。陽性細胞率B得分計分方法：0計為0分，≤25%計為1分，25%～50%計為2分，≥51%計為3分。AXB得分計為總得分0～9分，總得分0分計為陰性，1～2分計為弱陽性，3～8分計為中度陽性，9分計為強陽性。

Western blot蛋白印記技術(shù)結(jié)果評價方法：利用Quantity one分析軟件，在考慮到內(nèi)參蛋白的灰度值后，對目的條帶的灰度值進行分析比較。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 OA軟骨的HE及甲苯胺藍染色

OA軟骨HE染色，關(guān)節(jié)軟骨表層粗糙，軟骨細胞數(shù)量減少，軟骨細胞固縮，排列紊亂，放射層部分軟骨細胞集簇成團，軟骨基質(zhì)內(nèi)可見空的軟骨陷窩，基質(zhì)染色深淺不一。OA軟骨甲苯胺藍染色，表面不整齊，排列紊亂染色深淺不一，放射層顏色較正常軟骨組織淺。

2.2 Notch1、Notch3、Jagged-1、Jagged-2、HES5的表達

在正常軟骨細胞組中，Notch-1呈弱陽性表達；Jagged-1、Notch-3呈陰性表達；HES5、Jagged-2有表達，但是很不明顯(圖1)。在OA軟骨細胞組中，Notch1、HES5呈強陽性表達；Jagged-1、Jagged-2呈中度陽性表達；Notch-3呈弱陽性表達(圖2)。在DAPT組軟骨細胞中，Notch-1呈弱陽性表達，與OA組比較Notch-1表達量明顯下調(diào)；Jagged-1仍呈中度陽性表達，較OA組染色變淺，表達量下調(diào)；Jagged-2呈強陽性表達，較OA組表達情況可能有上調(diào)或者不變；HES5仍呈強陽性表達，與OA組比較，HES5表達量下調(diào)；Notch-3仍呈弱陽性表達，較OA表達量下調(diào)(圖3)。

在DLL組軟骨細胞中，Notch-1染色深度明顯加強，呈強陽性表達，與OA組比較Notch-1表達量明顯上調(diào)；Jagged-1呈中度陽性表達，與OA組比較，Jagged-1表達量無明顯變化；Jagged-2較OA組比較，染色明顯加深，呈強陽性表達，表達上調(diào)；HES5仍呈強陽性表達，與OA組比較，染色變深，HES5表達上調(diào)；Notch-3仍呈弱陽性表達，與OA組比較Notch-3表達量無明顯變化(圖4)。

2.3 Western blot蛋白質(zhì)印跡

免疫組化實驗完成后，下一步Western blot技術(shù)半定量檢測OA軟骨細胞中Notch-1、Jagged-1、Jagged-2、HES5、Notch-3的表達情況。Nocth-1表達量：DLL組>OA組>DAPT組，OA軟骨細胞中Notch-1大量表達，重組人Delta4蛋白干預(yù)后，Notch-1表達量顯著上調(diào)，γ-分泌酶抑制劑DAPT干預(yù)后，Notch-1表達量明顯下調(diào)，表達情況的變化與免疫組化結(jié)果類似。Jagged-1在DLL組以及OA組反應(yīng)帶著色相近，在DAPT組略有變淺并模糊，表明Jagged-1在OA軟骨中大量表達，重組人Delta4蛋白干預(yù)后，Jagged-1表達含量未出現(xiàn)明顯的下調(diào)或上調(diào)，γ-分泌酶抑制劑DAPT干預(yù)后，Jagged-1表達量有下調(diào)，這與免疫組化結(jié)果有相近之處。Jagged-2在3個組別中的反應(yīng)條帶未出現(xiàn)明顯大的差異變化，免疫組化結(jié)果顯示在OA軟骨細胞組、DAPT組、DLL組中均成強陽性表達，Western blot檢查結(jié)果與免疫組化結(jié)果基本相似。HES5表達量：DLL組>OA組>DAPT組，OA軟骨細胞中HES5存在大量表達，重組人Delta4蛋白干預(yù)后，HES5表達量上調(diào)，γ-分泌酶抑制劑DAPT干預(yù)后，HES5下調(diào)，DAPT抑制HES5的表達。Notch-3的三個反應(yīng)條帶，PBS組與DLL組著色均模糊無明顯差別，說明Notch-3在OA軟骨細胞以及DLL干預(yù)后，表達量無明顯變化，DAPT組無反應(yīng)條帶的出現(xiàn)，推測使用γ-分泌酶抑制劑DAPT干預(yù)，Notch-3明顯下調(diào)，與免疫組化結(jié)果相似(見圖5)。

a：Notch-1；b：Jagged-1；c：Jagged-2；d：HES5；e：Notch-3

a：Notch-1；b：Jagged-1；c：Jagged-2；d：HES5；e：Notch-3

a：Notch-1；b：Jagged-1；c：Jagged-2；d：HES5；e：Notch-3

圖5 Western blot蛋白印跡

3 討論

原發(fā)性O(shè)A的病因不明，發(fā)病與年齡、性別、職業(yè)、種族、肥胖、遺傳等多種因素有關(guān)[4,7]。OA發(fā)病機制目前尚不明確，多種信號通路、基因、細胞因子、趨化因子、蛋白酶等參與OA的病變過程[8]，在軟骨基質(zhì)降解過程中存在著多種信號通路、基因、蛋白酶、細胞因子等生物學(xué)因素的參與。Notch信號通路在多種動物及人軟骨發(fā)生、發(fā)育過程中表達并起著十分重要的作用[9]。Notch信號通路參與軟骨的發(fā)生、發(fā)育，與軟骨細胞的增殖、分化、凋亡密切相關(guān)[1,2,10-11]。Notch信號通路在OA軟骨中的表達水平變化[6]，說明Notch信號通路可能密切參與OA的病變過程。既往報道顯示Notch信號通路在對軟骨基質(zhì)的合成代謝和分解代謝都起著重要作用[10]。Mirando等[11]和Liu等[12]的研究均顯示，丟失了Notch信號通路的關(guān)節(jié)軟骨表現(xiàn)出類似于OA的病理過程，提示Notch信號通路在關(guān)節(jié)軟骨的表型維持上是必不可少的。Notch信號通路作用十分廣泛，除了經(jīng)典的DNA結(jié)合蛋白(C-promoter-binding factor-1，CBF1)依賴的信號傳導(dǎo)途徑外，還存在獨立CBF1的Notch信號傳導(dǎo)通路[13-14]。研究表明Notch同時抑制DLX4基因的表達和促進TNFRSF10C的表達，而DLX4抑制細胞凋亡，TNFRSF10C促進細胞凋亡[5]。OA中軟骨集簇細胞中較多細胞Notch表達陽性[15]。還有學(xué)者認為Notch信號高表達可能是軟骨細胞表型改變的結(jié)果[5,15-16]。本組結(jié)果發(fā)現(xiàn)Notch信號通路表達水平在OA中發(fā)生變化，軟骨細胞表型改變，Notch-1、Jagged-1、Jagged-2、HES5大量表達。γ-分泌酶抑制劑DAPT干預(yù)Notch信號通路后，抑制OA軟骨細胞中Notch-1、HES5、Jagged-1、Notch-3的表達，對Jagged-2的表達作用不明顯。重組人Delta4蛋白干預(yù)Notch信號通路后，促進Notch-1、Jagged-2、HES5的表達增加，對Jagged-1、Notch-3作用不太明顯。

Karlsson等[5]發(fā)現(xiàn)Notch-1、Jagged-1和HES5在OA軟骨中表達范圍較正常軟骨中的表達范圍明顯擴大。Notch1陽性率與OA軟骨Outerbridge分級相關(guān)，隨著軟骨退變的加重，淺層及中層軟骨細胞Notch1陽性率增高，深層軟骨細胞Notch1陽性率降低。同時發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)與OA軟骨細胞HES5表達呈正相關(guān)，阻斷Notch信號可以下調(diào)MMP13的表達。本實驗證實γ-分泌酶抑制劑DAPT可抑制OA軟骨細胞中HES5的表達，提示DAPT可通過MMP13途徑改變軟骨基質(zhì)代謝。Karlsson等[17]又通過軟骨培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Notch-1、Notch-2、Notch-3、Jagged-1、Jagged-2、Delta-1和Delta4在單層培養(yǎng)中表達。三維培養(yǎng)中Notch-1、Notch-2、Notch-3、Jagged-1、Delta-1和HES5表達明顯減少，并且無明確定位表達現(xiàn)象。Notch-2和Delta4在前7 d表達無明顯下降，且在7～14 d時升高。最近一項研究同樣顯示Notch信號通路的另一重要配體HES1可以誘導(dǎo)MMP13等分解代謝因子[13]。Liu等[18]的實驗證實Notch-1可分別于體內(nèi)和體外獨立激活包括IL-6在內(nèi)的多種炎性因子參與OA病理過程。本次實驗的DAPT與DLL均可對OA軟骨中的Notch-1產(chǎn)生明顯的作用，可能為潛在的治療藥物。

其他細胞因子也對Notch信號通路起調(diào)節(jié)作用，例如IL-1β和TNF-α抑制正常及OA軟骨細胞Notch-3、Jagged-1、HES5的表達，其中IL-1β輕度抑制其表達，TNF-α明顯抑制Notch-1表達。IL-1β明顯增加Delta4的表達，TNF-α只輕度增加Delta4的表達[5]。本組結(jié)果顯示，γ-分泌酶抑制劑DAPT能抑制Notch信號通路，Delta4蛋白能激動Notch信號通路，對軟骨細胞基質(zhì)代謝產(chǎn)生重要作用。Notch信號通路對OA的病理過程的影響十分復(fù)雜，具體作用機制還有待于進一步實驗研究。

綜上所述，Notch信號通路與OA軟骨代謝密切相關(guān)，Notch信號通路可能對OA軟骨細胞基質(zhì)合成具有重要作用，弄清Notch信號通路作用機制，能為Notch信號的調(diào)節(jié)提供理論依據(jù)，有利于通過Notch信號通路的調(diào)控改善OA軟骨細胞的代謝，減輕或延緩OA病變進展，為探索早期骨關(guān)節(jié)炎藥物治療提供理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1] Hardingham TE,Oldershaw RA,Tew SR.Cartilage,SOX9 and Notch signals in chondrogenesis[J].J Anat,2006,209(4):469-480.

[2] Karlsson C,Brantsing C,Svensson T,et al.Differentiation of human mesenchymal stem cells and articular chondrocytes:analysis of chondrogenic potential and expression pattern of differentiation-related transcription factors[J].J Orthop Res,2007,25(2):152-163.

[3] 周乙雄.骨關(guān)節(jié)炎——最常見的退行性關(guān)節(jié)疾病[J].中華關(guān)節(jié)外科雜志(電子版),2010,4(4):436-437.doi:10.3969/cma.j.issn.1674-134X.2010.04.001.

[4] 邱貴興.骨關(guān)節(jié)炎流行病學(xué)和病因?qū)W新進展[J].繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育,2005,19(7):68-69.doi:10.3969/j.issn.1004-6763.2005.07.020.

[5] Karlsson C,Brantsing C,Egell S,et al.Notch1，Jagged1 and HES5 are abundantly expressed in osteoarthritis[J].Cells Tissues Organs,2008,188(3):287-298.doi:10.1159/000121610.

[6] Geyer M,Grassel S,Straub RH,et al.Differential transcriptome analysis of intraarticular lesional vs intact cartilage reveals new candidate genes in osteoarthritis pathophysiology[J].Osteoarthritis Cartilage,2009,17(3):328-335.doi:10.1016/j.joca.2008.07.010.

[7] Loeser RF.Translational research in osteoarthritis-from molecules to animals to humans[J].J Musculoskelet Neuronal Interact,2008,8(4):301-302.

[8] 劉永剛,鮑雋君,邢自寶,等.骨性關(guān)節(jié)炎與細胞因子相關(guān)性研究進展[J].骨科,2010,1(2):105-107.doi:10.3969/j.issn.1674-8573.2010.02.020.

[9] 張衣北,陳安民,郭風(fēng)勁,等.激活的Notch1信號系統(tǒng)抑制前軟骨干細胞凋亡及其機制研究[J].中華小兒外科雜志,2006,27(11):592-595.doi:10.3760/cma.j.issn.0253-3006.2006.11.010.

[10] Kohn A,Dong Y,Mirando AJ,et al.Cartilage-specific RBPjκ-dependent and -independent Notch signals regulate cartilage and bone development[J].Development,2012,139(6):1198-1212.doi:10.1242/dev.070649.

[11] Mirando AJ,Liu Z,Moore T,et al.RBP-Jκ-dependent Notch signaling is required for murine articular cartilage and joint maintenance[J].Arthritis Rheum,2013,65(10):2623-2633.doi:10.1002/art.38076.

[12] Liu Z,Ren Y,Mirando AJ,et al.Notch signaling in postnatal joint chondrocytes,but not subchondral osteoblasts,is required for articular cartilage and joint maintenance[J].Osteoarthritis Cartilage,2016,24(4):740-751.doi:10.1016/j.joca.2015.10.015.

[13] Oldershaw RA,Hardingham TE.Notch signaling during chondrogenesis of human bone marrow stem cells[J].Bone,2010,46(2):286-293.doi:10.1016/j.bone.2009.04.242.

[14] Martinez Arias A,Zecchini V,Brennan K.CSL-independent Notch signalling:a checkpoint in cell fate decisions during development?[J].Curr Opin Genet Dev,2002,12(5):524-533.

[15] Hiraoka K,Grogan S,Olee T,et al.Mesenchymal progenitor cells in adult human articular cartilage[J].Biorheology,2006,43(3/4):447-454.

[16] Khan IM,Palmer EA,Archer CW.Fibroblast growth factor-2 induced chondrocyte cluster formation in experimentally wounded articular cartilage is blocked by soluble Jagged-1[J].Osteoarthritis Cartilage,2010,18(2):208-219.doi:10.1016/j.joca.2009.08.011.

[17] Karlsson C,Jonsson M,Asp J,et al.Notch and HES5 are regulated during human cartilage differentiation[J].Cell Tissue Res,2007,327(3):539-551.

[18] Liu Z,Chen J,Mirand AJ.et al.A dual role for NOTCH signaling in joint cartilage maintenance and osteoarthritis[J].Sci Signal,2015,8(386):ra71.doi:10.1126/scisignal.aaa3792.