高夢潔，賈春燕，姜林*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830000)

過敏性鼻炎是鼻炎中最常見的類型，我國過敏性鼻炎的患病率近年來也有顯著增加，可能與經(jīng)濟(jì)發(fā)展、工業(yè)化進(jìn)程加速、生活方式改變有關(guān)。盡管過敏性鼻炎不會危及生命，但會影響生活質(zhì)量，造成個人及社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，兒童會因此影響學(xué)習(xí)成績，嚴(yán)重者出現(xiàn)阻塞性睡眠呼吸障礙，甚至影響到頜面部發(fā)育[1]。因而對過敏性鼻炎作出正確的診斷，進(jìn)行有效地預(yù)防及治療就顯得尤為重要。蒼桂湯是新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院主任中藥師李風(fēng)森教授臨床應(yīng)用多年，在呼吸科得到廣泛應(yīng)用，治療過敏性鼻炎療效顯著的處方。此藥方傳統(tǒng)劑型為湯劑，攜帶不便，易霉變，故擬將其改為顆粒劑，使其便于攜帶，質(zhì)量穩(wěn)定。本方由白芷、蒼耳子、桂枝、辛夷等8味藥組成，其中白芷、蒼耳子、辛夷合而為君藥，桂枝、荊芥為臣藥，因白芷中的有效成分歐前胡素難溶于水，故在本方中以打粉加入。選擇君藥蒼耳子和辛夷中的綠原酸、木蘭脂素以及臣藥中桂枝所含的桂皮醛為指標(biāo)，優(yōu)化本方提取工藝。且木蘭脂素、綠原酸和桂皮醛相配合，均有治療鼻炎的作用[2-4]。由于金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、變形桿菌等為致鼻炎的主要菌種，故通過體外抑菌實驗所得到的抑菌作用評分為藥效學(xué)指標(biāo)，結(jié)合化學(xué)成分指標(biāo)，最終確定本方的提取工藝。本實驗以綜合評分(木蘭脂素、綠原酸、桂皮醛、抑菌作用評分)為評價指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，為該制劑的工業(yè)化大生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(美國Waters 公司，PAD 檢測器，Waters2695)；AG-135電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；超純水儀(Millipore公司，Direct-QTM5)；超聲清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；可控溫電熱套(山東城華魯電熱儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠，HH.B11.420)。

木蘭脂素、桂皮醛，綠原酸(批號分別為110882-201607、110710-200714、110753-200413，供定量測定用，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號分別為HB4114-19、HB0177-1，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)。

藥材飲片均購自新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，經(jīng)李永和主任中藥師鑒定，均符合2015 年版《中國人民共和國藥典》相關(guān)項下的要求。實驗用菌均購自新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 木蘭脂素含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 Symmetry C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-四氫呋喃-水(35∶1∶64)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：278 nm；進(jìn)樣量為20 μL。在此條件下樣品中木蘭脂素能達(dá)到良好的分離，理論板數(shù)按木蘭脂素峰計算不低于3000[5-6]。

2.1.2 供試品溶液制備 取本方10倍量水提液50 mL，置分液漏斗中，用乙酸乙酯振搖萃取3次，分別為20、20、10 mL，合并萃取液，揮干，用適量甲醇溶解后，轉(zhuǎn)入5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[7]。

2.1.3 對照品溶液的制備 取木蘭脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含0.18 mg的溶液，即得。

2.1.4 陰性供試品溶液制備 稱取處方量缺辛夷藥材，其他操作同2.1.2，結(jié)果見圖1。

注：A.木蘭脂素對照品；B.樣品；C.陰性樣品。圖1 木蘭脂素HPLC圖

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取木蘭脂素對照品適量，精密稱定，加入適量甲醇(色譜純)，配置成一定濃度的儲備液；精密梯度吸取5個不同體積的儲備液，分別置于相同體積容量瓶中，加甲醇(色譜純)稀釋至刻度，搖勻，即得。得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=116 447.45X+1 127.9，r=0.998 2。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，取對照品溶液按2.1.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算木蘭脂素峰面積的RSD為0.81%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 用同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量20 μL，根據(jù)結(jié)果計算重復(fù)性RSD為0.57%。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測定樣品木蘭脂素峰面積，RSD為1.25%。

2.1.9 加樣回收率試驗 取已知濃度的待測溶液6份，精密加入2.5 mg的木蘭脂素對照品，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)行含量測定，其平均回收率為103.4%，RSD為2.24%。

2.2 桂皮醛含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 Symmetry C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(32∶68)；流速：l.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：290 nm；進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按桂皮醛峰計算應(yīng)不低于3000[8]。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本方10倍量水提液，離心，取上清液5 mL，用甲醇定容于10 mL量瓶中，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 對照品溶液的制備 取桂皮醛對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含0.4 mg的溶液。

2.2.4 陰性供試品溶液制備 稱取處方量缺桂枝藥材，其他操作同2.2.2，結(jié)果見圖2。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取桂皮醛對照品適量，精密稱定，加入適量甲醇(色譜純)，配置成一定濃度的儲備液；精密梯度吸取5個不同體積的儲備液，分別置于相同體積容量瓶中，加甲醇(色譜純)稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=525 491.8X-179 850.8，r=0.999 7。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，取對照品溶液按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算桂皮醛峰面積的RSD為0.55%，表明儀器精密度良好。

注：A.桂皮醛標(biāo)準(zhǔn)品；B.樣品；C.樣品陰性。圖2 桂皮醛HPLC圖

2.2.7 重復(fù)性試驗 用同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量10 μL，根據(jù)結(jié)果計算重復(fù)性RSD為0.33%。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測定樣品桂皮醛峰面積，RSD為1.95%。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知濃度的待測溶液6份，精密加入3.3 mg的桂皮醛對照品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進(jìn)行含量測定，其平均回收率為99.24%，RSD為2.78%。

2.3 綠原酸的含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 Symmetry C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.4%磷酸(10∶90)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：327 nm；進(jìn)樣量為10 μL。在此條件下樣品中綠原酸能達(dá)到良好的分離，理論板數(shù)按綠原酸峰計算不低于3000[8]。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本處方10倍量水提液，離心，取上清液10 mL，水浴蒸干，用甲醇5 mL溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

2.2.4 陰性供試品溶液制備 稱取處方量缺蒼耳子藥材，其他操作同2.2.2，結(jié)果見圖3。

注：A.綠原酸對照品；B.樣品；C.樣品陰性。圖3 綠原酸HPLC圖

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取綠原酸對照品適量，精密稱定，加入適量甲醇(色譜純)，配置成一定濃度的儲備液；精密梯度吸取5個不同體積的儲備液，分別置于相同體積容量瓶中，加甲醇(色譜純)稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)曲為Y=1 221 440.541X+10 511.648 65，r=0.999 7。

2.3.6精密度試驗 精密吸取對照品溶液，取對照品溶液按2.3.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算綠原酸峰面積的RSD為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.3.7重復(fù)性試驗 用同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量10 μL，根據(jù)結(jié)果計算重復(fù)性RSD為1.61%。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取同供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h測定樣品綠原酸峰面積，RSD為1.38%。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知濃度的待測溶液6份，精密加入9.6 mg的綠原酸對照品，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進(jìn)行含量測定，其平均回收率為101.08%，RSD為2.75%。

2.4 單因素試驗

2.4.1 浸泡時間的考察 將提取次數(shù)固定為2次，提取時間固定為1.5 h，加水倍數(shù)固定為10倍，分別考察浸泡時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h對綜合評分的影響，結(jié)果各評價指標(biāo)含量在0.5～1.0 h呈遞增趨勢，1.0～2.5 h無明顯變化，故以1.0 h為最佳浸泡時間。

2.4.2 提取時間的考察 將提取次數(shù)固定為2次，加水倍數(shù)固定為10倍，浸泡時間固定為1.0 h，分別按0.5、1、1.5、2、2.5 h進(jìn)行提取，結(jié)果在0.5～1.5 h內(nèi)各評價指標(biāo)含量呈增長趨勢，1.5 h后呈下降趨勢，故以1.5 h為最佳提取時間。

2.4.3 加水倍數(shù)的考察 將提取次數(shù)固定為2次，浸泡時間固定為1.0 h，提取時間固定為1.5 h，分別按8、10、12、14、16倍進(jìn)行提取，結(jié)果各評價指標(biāo)含量在8～10倍呈遞增趨勢，10～16倍呈遞減趨勢，故以10倍為最佳提取倍數(shù)。

2.4.4 提取次數(shù)的考察 將加水倍數(shù)固定為10倍，浸泡時間固定為1.0 h，提取時間固定為1.5 h，分別按1次、2次、3次進(jìn)行提取，結(jié)果各評價指標(biāo)含量在提取1～3次呈增加趨勢，但2次和3次相差不大，結(jié)合實際生產(chǎn)情況選取2次為最佳提取次數(shù)。單因素數(shù)據(jù)見表1。

2.5 體外抑菌實驗

表1 單因素試驗結(jié)果

按照單因素篩選出的結(jié)果提取藥液，即浸泡時間1 h，提取時間1.5 h，10倍量水提取2次。以培養(yǎng)基將藥液稀釋成為每mL含總藥材4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.063 g共7個濃度，經(jīng)高壓消毒后，將活化的細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、變形桿菌)加入上述培養(yǎng)基中，另設(shè)空白對照(有菌無藥)管。因藥物加入培養(yǎng)基后顏色太深，無法觀察其混濁程度，影響結(jié)果判斷，故恒溫培養(yǎng)24～48 h后，將各管培養(yǎng)物劃線接種于平板培養(yǎng)基上，再次培養(yǎng)24～48 h，觀察實驗菌生長情況，確定無菌生長的藥物濃度即為最低抑菌濃度(MIC)[9-10]。將恒溫培養(yǎng)24～48 h后的培養(yǎng)物涂布于瓊脂培養(yǎng)基平板上，再次培養(yǎng)24～48 h，觀察平板上菌落形成單位(CFU)。CFU≤5的濃度為殺菌濃度，記“-”號，CFU>5的濃度為無殺菌作用，記“+”號。以產(chǎn)生殺菌作用的最小濃度為最低殺菌濃度(MBC)。結(jié)果，本品對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、變形桿菌的最低抑菌濃度分別為2、2、2、2、2 g·mL-1，最低殺菌濃度分別為4、2、2、2、2 g·mL-1，結(jié)果見表2。證明本品具有一定的抑菌作用，可進(jìn)入星點設(shè)計，進(jìn)行提取工藝的優(yōu)選。

表2 體外抑菌實驗

2.6 提取工藝優(yōu)選

2.6.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇浸泡時間、提取時間和加水倍數(shù)作為影響因素，固定提取次數(shù)為2次。抑菌作用需將提取液均濃縮至藥物濃度2 g·mL-1，然后以涂布后所增長的菌落數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理(菌落數(shù)為0記為100分，菌落數(shù)多致無法計算記為1分，100-菌落數(shù)/100，即將分值正向化處理后得出每種提取工藝對5個菌抑菌作用的平均值，計算抑菌作用評分)后帶入星點設(shè)計，綜合評分(木蘭脂素、桂皮醛、綠原酸含量，抑菌作用評分)為評價指標(biāo)(根據(jù)本方中各化學(xué)指標(biāo)對本方藥效貢獻(xiàn)程度的大小以及本方主要藥效學(xué)指標(biāo)的綜合考慮，決定其權(quán)重系數(shù)分別為30%、20%、20%、30%)，采用Design-Expert8.0.4軟件Central Composite試驗設(shè)計的方案進(jìn)行研究，篩選最佳提取條件[11-12]。結(jié)果見表3～4。

2.6.2 模型的擬合采用 ANOVA對各因素進(jìn)行多元二次回歸，得到二次擬合方程為Y=82.68-0.73A-4.10B+9.36C-0.51AB-7.50×10-3AC+1.41BC-1.16A2-1.68B2-7.18C2。對其進(jìn)行方差分析，可知B、C、B2、C2具有顯著性影響，失擬項>0.05，表明失擬項不顯著，相關(guān)系數(shù)r=0.970 1，表明回歸方程擬合度較好，試驗誤差小，可用該模型對不同條件下的試驗結(jié)果進(jìn)行測定。根據(jù)回歸分析結(jié)果，利用軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖4。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 方差分析

注：“—”為無法比較。

注：A.浸泡時間和水提倍數(shù)對綜合評分的影響；B.水提倍數(shù)和提取時間對綜合評分的影響；C.浸泡時間和提取時間對綜合評分的影響。圖4 提取工藝中各因素對綜合評分的影響

2.6.3 驗證試驗 通過對實驗數(shù)據(jù)的綜合分析，可知最優(yōu)工藝為浸泡56.96 min，加8.05倍量水提取2次，每次76.71 min?？紤]到實際生產(chǎn)需要，將提取工藝定為浸泡60 min，加8倍量水提取2次，每次80 min。再進(jìn)行3次驗證試驗，結(jié)果木蘭脂素平均含量為9.58 mg·g-1；桂皮醛平均含量為11.33 mg·g-1；綠原酸平均含量為11.49 μg·g-1；抑菌作用平均評分為88.11%。綜合評分與預(yù)測值的偏差為0.47%，表明該二項式模型擬合效果良好，可信度高。按最終提取工藝提取本方，做體外抑菌實驗，進(jìn)行涂布和劃線，結(jié)果本品對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、變形桿菌的最低抑菌濃度分別為2、2、2、2、2 g·mL-1，最低殺菌濃度分別為4、2、2、2、2 g·mL-1。

3 討論

本文通過單因素考察篩選出各因素的最佳范圍進(jìn)入星點試驗，再通過星點設(shè)計，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。本方為治療鼻炎的經(jīng)驗方，以君藥和臣藥中主要成分為化學(xué)成分指標(biāo)；所選取的5種菌是導(dǎo)致鼻炎的主要菌種，通過體外抑菌實驗確定了本方對這5種菌具有一定的抑菌作用，故將抑菌作用評分作為本方的藥效學(xué)指標(biāo)。將藥效學(xué)指標(biāo)和化學(xué)成分指標(biāo)相結(jié)合，綜合評價提取工藝，進(jìn)一步優(yōu)化了本方的提取方法，這是本文的一個創(chuàng)新點，同時也為中藥復(fù)方提取工藝的篩選提供了新思路。

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