史晴晴，黃寧，郭洋洋

(廊坊市第四人民醫(yī)院，河北 廊坊 065700)

腦血管病已經(jīng)逐漸發(fā)展成為危害人類健康的主要疾病之一，其中缺血性腦血管病占80%左右，具有極高的致殘率和致死率[1]。認知功能損傷是腦缺血病早期的主要臨床表現(xiàn)，進一步可能發(fā)展成為認知與神經(jīng)功能障礙。Lee等[2]研究發(fā)現(xiàn)慢性腦血流灌注不足是認知功能下降的重要觸發(fā)因素。白芍總苷為中藥白芍的主要活性成分之一，具有抑制自身免疫、抗炎、抗氧化等多種活性[3-4]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷能夠通過抑制神經(jīng)元凋亡、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)對腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，并且對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元具有保護作用[5-6]。

1 材料

1.1 實驗動物

健康清潔級SD大鼠(雌雄不限)，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(冀)2013-1-003，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 藥物與試劑

白芍總苷膠囊(寧波立華制藥有限公司，批號：20161124)。HE、TUNEL試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Bcl-2、Bax多克隆抗體和ABC-DAB試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒(安徽欣樂生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備與給藥

將100只實驗用大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型對照組和白芍總苷(50、100、200 mg·kg-1)組，每組20只。參照羅偉等[7]報道的實驗方法，通過結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈制備慢性腦缺血大鼠模型，假手術(shù)組游離頸總動脈但不結(jié)扎。術(shù)后第二天，白芍總苷各劑量組分別灌胃給藥，假手術(shù)組和模型對照組大鼠均同步給予0.9%氯化鈉溶液，每天1次，共28 d。

2.2 Morris水迷宮實驗

給藥治療28 d后，每組隨機選取10只大鼠，行Morris水迷宮實驗(Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司)。水迷宮為直徑1.3 m、深0.5 m的圓柱形水桶裝置，置暗室中，設(shè)置水溫為25 ℃恒溫，劃分為I、II、III、IV共4個象限，將安全平臺(直徑10 cm，高30 cm)放于第3象限(水面下2 cm)，水迷宮上方安置電腦系統(tǒng)相連接的攝像機以記錄大鼠運動軌跡。1)定位航行實驗：實驗前1天適應(yīng)性訓(xùn)練2 min，實驗歷時5 d，每天每只大鼠分別從I、II、III、IV象限面向水迷宮池壁放入，記錄大鼠120 s內(nèi)的游泳軌跡和站上平臺所需的時間(逃避潛伏期)，站上平臺后停留30 s，若120 s內(nèi)未找到平臺則逃避潛伏期記為120 s。2)空間探索實驗：第6天撤去平臺，大鼠于第II象限面向水迷宮池壁放入，觀察并記錄90 s內(nèi)大鼠穿越原來平臺位置次數(shù)。

2.3 跳臺實驗

取每組剩余的10只大鼠，實驗前1天將大鼠置于反應(yīng)箱中適應(yīng)3 min，實驗時將大鼠放在平臺上并接通銅柵電源，記錄各組大鼠3 min內(nèi)錯誤次數(shù)和受電擊總時間；第2天，直接將大鼠放于接通銅柵電源的平臺上，記錄3 min內(nèi)錯誤次數(shù)和受電擊總時間。

2.4 大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及凋亡狀況的觀察

每組隨機取10只大鼠，參照葉志強等[8]報道的實驗方法：麻醉后斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，然后行石蠟包埋、切片、展片處理，行常規(guī)HE染色：75%乙醇梯度脫蠟水化、PBS洗滌、蘇木素染色5 min、水洗、0.5%乙醇鹽酸分色、尹紅染色20 s、水洗、75%乙醇梯度脫水、封片，然后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)(海馬CA1區(qū)范圍見圖1)；在顯微鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)每個視野神經(jīng)元數(shù)(神經(jīng)元數(shù)/視野)。行TUNEL染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況。每只大鼠取5張切片，每張切片隨機選取互不重疊的5個視野，并分別計數(shù)細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)，然后按公式(1)計算凋亡指數(shù)(AI)。

AI(%)=(凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%

(1)

圖1 大鼠大腦海馬組織結(jié)構(gòu)圖

2.5 IHC法檢測海馬Bcl-2、Bax表達

取2.4制備的大鼠腦組織石蠟切片，脫蠟水化處理后，參照試劑盒操作方法步驟，采用ABC-DAB法進行染色：75%乙醇梯度脫蠟水化、PBS洗滌、3%過氧化氫-甲醇溶液孵育25 min、PBS洗滌、山羊血清封閉1.5 h、滴加一抗4 ℃過夜、PBS洗滌、滴加二抗室溫孵育1.5 h、PBS洗滌、滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫孵育1 h、PBS洗滌、DAB顯色5 min、充分水洗、梯度脫水、封片，然后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察并照相保存。每只大鼠取5張切片，每張圖片同一部位選取互不重疊的5個視野，采用Image Pro plus圖像分析系統(tǒng)測定圖片灰度。

2.6 抗氧化酶活性和MDA含量的測定

取每組剩余的10只大鼠，實施麻醉后斷頭取腦并剝?nèi)『ｑR組織，加入適量冷裂解液進行研磨勻漿，離心(3000 r·min-1，10 min)取上清液，按照試劑盒方法測定海馬組織抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性和MDA含量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 白芍總苷對腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

3.1.1 Morris水迷宮實驗 于給藥治療28 d完成后進行定位航行實驗，連續(xù)5 d取平均值(第29～33天)：模型對照組大鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組顯著增加(P<0.01)、逃避路程顯著增長(P<0.01)；而與模型組比較，經(jīng)100、200 mg·kg-1白芍總苷干預(yù)治療28 d能夠顯著降低腦缺血大鼠逃避潛伏期并縮短逃避路程(P<0.05或P<0.01)。于給藥治療28 d并進行定位航行實驗5 d后，進行空間探索實驗(第34天)：模型對照組大鼠穿越原平臺位置次數(shù)較假手術(shù)組顯著增多(P<0.01)；而與模型組比較，經(jīng)100、200 mg·kg-1白芍總苷干預(yù)治療28 d能夠顯著降低腦缺血大鼠穿越原平臺位置次數(shù)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表1。

3.1.2 跳臺實驗 給藥治療28 d完成后，連續(xù)兩天進行跳臺實驗(第29～30天)，取跳臺第二天實驗數(shù)據(jù)：模型對照組大鼠錯誤次數(shù)較假手術(shù)組顯著增多(P<0.01)，受電擊總時間顯著延長(P<0.01)；而與模型組比較，經(jīng)100、200 mg·kg-1白芍總苷干預(yù)治療28 d能夠顯著減少腦缺血大鼠錯誤次數(shù)并縮短受電擊時間(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表2。

3.2 白芍總苷對腦缺血大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響

圖2顯示，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元未見異常：層次清晰(3～5層)，排列整齊，形態(tài)完整，胞質(zhì)染色均勻，核膜、核仁清晰；模型對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯異常：層次紊亂，神經(jīng)元數(shù)量減少、排列稀疏、間隙增大，膠質(zhì)細胞增加，部分神經(jīng)元胞核固縮或溶解，核仁消失等；與模型對照組比較，白芍總苷各劑量干預(yù)治療組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病變呈不同程度減輕，該藥理學(xué)作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，以白芍總苷200 mg·kg-1組效果最為顯著。計數(shù)各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)，放大倍數(shù)為400倍(10×40)，視野面積0.16 mm2，正常對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)/視野為(66.7±8.2)個，模型組神經(jīng)元數(shù)/視野為(25.3±4.1)個，較正常對照組顯著降低(P<0.01)，白芍總苷50、100、200 mg·kg-1組神經(jīng)元數(shù)/視野分別為(31.6±4.5)、(40.7±4.9)、(48.6±6.2)個，較模型組顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

表1 白芍總苷對腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響-Morris水迷宮實驗

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01；下同。

表2 白芍總苷對腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響-跳臺實驗

注：A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.白芍總苷50 mg·kg-1組；D.白芍總苷100 mg·kg-1組；E.白芍總苷200 mg·kg-1組。圖2 各組大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)(HE，×400)

3.3 白芍總苷對腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響

圖3顯示，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)僅見少量凋亡細胞(TUNEL染色陽性著色：細胞核黃褐色)；模型對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡細胞數(shù)較假手術(shù)組明顯增多；與模型對照組比較，白芍總苷各劑量干預(yù)組海馬CA1區(qū)凋亡細胞數(shù)呈不同程度減少，以白芍總苷200 mg·kg-1組最為顯著。計算并比較各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)(AI)：假手術(shù)組AI為(2.7±1.1)%，模型對照組AI為(64.9±8.6)%，白芍總苷(50、100、200 mg·kg-1)組AI分別為(59.3±10.4)%、(41.1±6.8)%、(15.6±3.5)%；模型對照組AI較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)，經(jīng)100、200 mg·kg-1白芍總苷干預(yù)治療能夠顯著降低腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元AI(P<0.01)。

注：A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.白芍總苷50 mg·kg-1組；D.白芍總苷100 mg·kg-1組；E.白芍總苷200 mg·kg-1組。圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況(TUNEL，×400)

3.4 白芍總苷對腦缺血大鼠海馬Bcl-2、Bax表達的影響

觀察IHC染色切片發(fā)現(xiàn)，Bax和Bcl-2主要于細胞質(zhì)中表達；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬Bcl-2表達明顯下調(diào)、灰度顯著降低(P<0.01)，Bax表達顯著上調(diào)、灰度顯著升高(P<0.01)；而與模型組比較，白芍總苷各劑量干預(yù)組海馬Bcl-2表達上調(diào)、Bax表達下調(diào)，上述作用呈一定劑量依賴性，以白芍總苷200 mg·kg-1組效果最為顯著；白芍總苷(100、200 mg·kg-1)組Bcl-2表達灰度較模型對照組均顯著升高(P<0.05或P<0.01),Bax表達灰度較模型對照組均顯著降低(P<0.01)，Bcl-2/Bax值顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見圖4、5和表3。

3.5 白芍總苷對全腦缺血再灌注大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量的影響

模型對照組抗氧化酶活性較假手術(shù)組顯著降低且MDA含量顯著升高(P<0.01)；經(jīng)100、200 mg·kg-1白芍總苷干預(yù)治療能夠顯著提高抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性并顯著降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表4。

4 討論

注：A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.白芍總苷50 mg·kg-1組；D.白芍總苷100 mg·kg-1組；E.白芍總苷200 mg·kg-1組。圖4 各組大鼠海馬Bcl-2表達(IHC，×400)

注：A.假手術(shù)組；B.模型對照組；C.白芍總苷50 mg·kg-1組；D.白芍總苷100 mg·kg-1組；E.白芍總苷200 mg·kg-1組。圖5 各組大鼠海馬Bax表達(IHC，×400)

組別動物/只Bcl?2BaxBcl?2/Bax假手術(shù)組10137 2±54 986 9±25 11 6±1 1模型對照組1049 6±21 5??207 5±56 8??0 3±0 2??白芍總苷50mg·kg-1組治療組1068 4±29 0183 4±47 60 5±0 2白芍總苷100mg·kg-1組1089 5±37 2△141 3±42 8△0 8±0 5△白芍總苷200mg·kg-1組10112 6±46 7△△124 8±35 2△△1 0±0 6△△

表4 各組大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量 /U·mg-1

慢性腦缺血引發(fā)的能量代謝障礙、蛋白合成異常、神經(jīng)元缺失等是導(dǎo)致血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)、皮質(zhì)下動脈硬化性腦病(Binswanger)等多種腦血管疾病的病理通路[9]，甚至可能導(dǎo)致認知功能障礙[10]，臨床表現(xiàn)主要為漸進性癡呆、學(xué)習(xí)能力和記憶能力顯著下降，目前臨床上尚無針對性的治療藥物，主要采取擴張血管、抗凝溶栓、改善腦循環(huán)等治療方案[11]。

海馬結(jié)構(gòu)不僅與多種神經(jīng)性和精神性疾病相關(guān)，而且與空間學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，海馬對缺血缺氧十分敏感，尤其CA1區(qū)椎體系細胞極易受缺血缺氧損傷，宿寶貴等[12]和李長天等[13]研究報道腦部血流低灌注引起海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷可能是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力障礙的病理基礎(chǔ)。Burda等[14]研究發(fā)現(xiàn)腦缺血所致神經(jīng)功能損傷與海馬神經(jīng)元繼發(fā)性凋亡有關(guān)，及時恢復(fù)腦血流供應(yīng)挽救缺血半影區(qū)神經(jīng)元，對缺血性腦損傷具有積極的保護作用。Bcl-2基因家族是一系列原癌基因蛋白，在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其中Bcl-2和Bax具有較高的同源性，但功能相反[15]。Bcl-2能夠通過抑制線粒體細胞色素C釋放，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)激活，表現(xiàn)出抑制細胞凋亡的作用；Bax能夠促進細胞色素C釋放，激活caspase-9，并且能夠與Bcl-2形成二聚體而抑制Bcl-2活性，因此Bax具有促凋亡的作用，而Bax/bcl-2比值更加能夠體現(xiàn)Bcl-2基因家族對細胞凋亡的調(diào)控作用[16]。正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)生產(chǎn)的氧自由基(ROS)在SOD和CAT、GSH-Px的催化作用下最終被還原為對人體無害的H2O和O2[17]；不飽和脂肪酸是細胞膜的主要組成之一，極易被ROS攻擊而氧化最終生成MDA，因此MDA的含量水平能夠間接反應(yīng)機體氧化應(yīng)激損傷程度[18]，此外氧化應(yīng)激損傷是誘發(fā)細胞凋亡的重要因素[19]。

張華龍等[4，20]和鄭亞萍等[21]研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷能夠通過改善抗氧化酶活性而抑制心肌缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷、通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達而抑制心肌缺血再灌注后細胞凋亡，從而表現(xiàn)出對心肌缺血再灌注損傷的保護作用；此外，劉瑋等[22]和吳華璞等[23]研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷能夠通過抑制氧化應(yīng)激損傷對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷以及全腦缺血再灌注損傷均具有一定的保護作用。本研究中，Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，100～200 mg·kg-1白芍總苷能夠顯著降低腦缺血大鼠逃避潛伏期并縮短逃避路程，顯著降低腦缺血大鼠穿越原平臺位置次數(shù)；跳臺實驗結(jié)果顯示，100～200 mg·kg-1白芍總苷治療能夠顯著減少腦缺血大鼠錯誤次數(shù)并縮短受電擊時間。經(jīng)白芍總苷治療能夠明顯上調(diào)海馬Bcl-2表達、下調(diào)Bax表達、提高Bcl-2/Bax值，改善抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性并降低MDA含量；提示白芍總苷對腦缺血后學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用，可能與白芍總苷調(diào)控海馬凋亡相關(guān)基因(Bcl-2、Bax)表達、降低氧化應(yīng)激損傷、抑制海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

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