鄭迪，代國，張政佩，陶春杰，余鈴，郭衛(wèi)春

(武漢大學(xué) 人民醫(yī)院 骨科，湖北 武漢 430060)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)平均每年新增乳腺癌患者約170萬例，并且其發(fā)病率還在不斷提升[1]。遠處轉(zhuǎn)移是乳腺癌致死的主要原因，而骨組織則是乳腺癌常見的轉(zhuǎn)移位點[2-3]。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移造成溶骨性破壞，進而導(dǎo)致高鈣血癥、病理性骨折、疼痛、神經(jīng)功能損害等一系列骨相關(guān)事件[4-5]，對患者的生活造成嚴(yán)重影響。研究表明，轉(zhuǎn)移到骨組織的腫瘤細胞能分泌甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)，通過促進核因子κβ受體活化因子配體(RANKL)分泌并減少骨保護素(OPG)合成，造成RANKL/OPG的比例失調(diào)，進而促進破骨細胞分化和成熟，造成骨質(zhì)破壞，骨基質(zhì)中儲存的TGF-β大量釋放又反過來促進乳腺癌細胞分泌PTHrP，由此完成乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的“惡性循環(huán)”[6]。因此，通過抑制腫瘤細胞分泌PTHrP有望成為抑制乳腺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移進程的有效手段。

華蟾素(Cinobufacini)是蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍的全皮經(jīng)提取加工制成的水溶性制劑，具有消腫止痛、活血化瘀和清熱解毒等功效，目前臨床上主要用于肝癌、肺癌、食管癌等腫瘤的綜合治療[7-8]。本研究基于華蟾素的抗腫瘤特性，研究其對MDA-MB-231細胞增殖、遷移及凋亡的影響，探索其抗乳腺癌的相關(guān)分子機制，并初步探索華蟾素對MDA-MB-231細胞PTHrP表達的影響，為后續(xù)進一步研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

人TNBC細胞株MDA-MB-231購自中國科學(xué)院細胞庫上海保藏中心；華蟾素(安徽金蟾生化股份有限公司，每支10 mL，批號：160904)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；新生胎牛血清[Gibco公司(澳洲)]；1%雙抗[青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 μg·mL-1，吉諾公司(杭州)]；胰酶(武漢谷歌生物科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；CCK-8試劑盒(南京碧云天公司)；兔抗人Bax、Bcl-2、PTHrP、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、β-actin抗體(美國CST公司)；HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 儀器

倒置顯微鏡(Olympus，Japan)；自動酶標(biāo)儀(Tecan Sunrise，Austria)；流式細胞儀FACSCalibur(Becton-Dickinson，San Jose，CA，USA)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

MDA-MB-231乳腺癌細胞培養(yǎng)在含有10%新生胎牛血清、1%雙抗(青霉素100 U·mL-1，鏈霉素100 μg·mL-1)的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

將MDA-MB-231細胞以每孔2×105個接種于6孔板中，24 h后分別加入0、10、20、40、60、80 μg·mL-1華蟾素，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，在倒置顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)變化并拍照。

2.3 細胞增殖能力檢測

將MDA-MB-231細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)3個復(fù)孔，孵育24 h待細胞貼壁后加入不同質(zhì)量濃度的華蟾素(0、10、20、40、60、80、100 μg·mL-1)，分別培養(yǎng)24、48 h，然后每孔加入10 μL CCK-8試劑和90 μL培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育1.5 h，用自動酶標(biāo)儀(Tecan Sunrise，Austria)測量每孔細胞在450 nm波長下的吸光度(A)，所有實驗均進行3次，按公式(1)計算細胞活力。

(1)

2.4 劃痕實驗

取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，以每孔5×104個接種于12孔板中，待細胞長到完全融合后，用無菌100 μL槍頭在每個孔底劃出一條直線，PBS洗2次，用倒置顯微鏡拍照后，分別加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基，并調(diào)整華蟾素質(zhì)量濃度為0、20、40、80 μg·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合度，拍照記錄，每組實驗重復(fù)3次，按公式(2)計算細胞遷移率。

(2)

2.5 細胞凋亡分析

取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板中，每孔5×105個，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，加入不同質(zhì)量濃度的華蟾素(0、20、40、80 μg·mL-1)處理24 h，用0.25%胰酶消化，收集細胞，離心棄上清液后用冷PBS洗滌2次，加入500 μL binding buffer重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min后，用流式細胞儀進行細胞凋亡率的檢測。

2.6 Western Blot

用華蟾素(40 μg·mL-1)處理MDA-MB-231細胞24 h后，去除培養(yǎng)基，冷PBS洗滌2次，加入裂解液提取胞質(zhì)蛋白，行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜后用5%封閉液于4 ℃封閉1.5 h，加入相應(yīng)一抗孵育過夜，濾膜經(jīng)TBS緩沖液漂洗3次后，加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，增強化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色，使用ImageJ軟件進行灰度分析，β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參照。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 華蟾素對MDA-MB-231細胞形態(tài)的影響

用不同質(zhì)量濃度(0、10、20、40、60、80 μg·mL-1)的華蟾素處理MDA-MB-231細胞48 h后，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過48 h處理后，對照組細胞生長貼壁良好，細胞間間隙小，細胞密集、密度大(見圖1A)；而華蟾素處理組中，細胞皺縮變圓，貼壁能力降低，并且隨著華蟾素質(zhì)量濃度的增加，細胞數(shù)量及密度明顯減少(見圖1B～F)。

注：A.對照組；B～F.分別為10、20、40、60、80 μg·mL-1華蟾素處理組。圖1 華蟾素對MDA-MB-231細胞形態(tài)的影響(×100)

3.2 華蟾素對MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用

為了研究華蟾素對MDA-MB-231細胞增殖的影響，我們用不同質(zhì)量濃度(0、10、20、40、60、80、100 μg·mL-1)的華蟾素處理MDA-MB-231細胞24 h和48 h。圖2 CCK-8結(jié)果顯示，華蟾素可以抑制MDA-MB-231細胞增殖，降低其活力，并且隨著華蟾素質(zhì)量濃度的增加和作用時間的延長，其細胞活力不斷下降，說明華蟾素可以時間、濃度依賴性地抑制MDA-MB-231細胞的增殖，體現(xiàn)出對MDA-MB-231細胞的毒性作用。

注：與對照組相比，*P <0.05，**P <0.01；下同。圖2 華蟾素體外細胞抑制作用

3.3 華蟾素對MDA-MB-231細胞遷移的影響

華蟾素對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響如圖3所示。對照組細胞經(jīng)過48 h處理后，與0 h相比生長明顯，劃痕愈合明顯(見圖3A～B)，而華蟾素處理組隨著華蟾素濃度(20、40、80 μg·mL-1)的增加，經(jīng)過48 h處理后，劃痕愈合趨勢不明顯；當(dāng)用80 μg·mL-1華蟾素處理MDA-MB-231細胞48 h后，細胞生長稀疏，未見劃痕愈合趨勢(見圖3E)。圖4表明，華蟾素可以抑制MDA-MB-231細胞的遷移；并且隨著華蟾素濃度的增加，MDA-MB-231細胞遷移率逐漸降低。

3.4 華蟾素對MDA-MB-231細胞凋亡的影響

使用不同質(zhì)量濃度(20、40、80 μg·mL-1)華蟾素處理MDA-MB-231細胞24 h后，采用FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測MDA-MB-231細胞凋亡率(細胞凋亡率=早期細胞凋亡率+晚期細胞凋亡率)。圖5結(jié)果表明，細胞凋亡率隨著華蟾素濃度的增加而顯著提高，與空白對照組相比，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.5 華蟾素對凋亡相關(guān)蛋白及PTHrP表達的影響

為了進一步探究華蟾素抑制MDA-MB-231細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡的分子機制，我們檢測了Bax、Bcl-2、Cleaved capsase-3和Cleaved caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白的表達。Western Blot結(jié)果表明(見圖6)，與對照組相比，華蟾素處理組中，Bax、Cleaved capsase-3和Cleaved caspase-9表達水平均明顯上調(diào)，而Bcl-2的表達則明顯減少。此外，我們還研究了華蟾素對PTHrP表達的影響，結(jié)果表明華蟾素可以抑制MDA-MB-231細胞中PTHrP的表達。

注：A～B.分別為對照組0 h和48 h；C～E.分別為20、40和80 μg·mL-1華蟾素處理組48 h圖3 華蟾素對MDA-MB-231細胞劃痕修復(fù)實驗結(jié)果(×100)

圖4 華蟾素對MDA-MB-231細胞遷移率結(jié)果

4 討論

乳腺癌是惡性腫瘤中導(dǎo)致女性死亡的首要因素[9]，據(jù)統(tǒng)計占女性新增癌癥病例的四分之一以上[10]。目前，對于乳腺癌患者的治療，主要包括外科手術(shù)、放療和化療。盡管目前治療取得了明顯進步，但仍無法令人滿意。三陰性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌中的一種亞型，其雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2均為陰性，具有惡性程度高、侵襲能力強、容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等特點，對內(nèi)分泌治療及抗HER2靶向治療不敏感[11-12]，目前對于此類患者，仍缺乏有效治療手段。晚期乳腺癌患者中有70%左右出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移[13]，遠遠高于其他器官，而TNBC相對于其他亞型更容易出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移，因此，尋找新的藥物以改善乳腺癌，特別是TNBC患者的預(yù)后，是目前臨床上亟待解決的難題。

注：A.對照組；B～D.分別為20、40和80 μg·mL-1華蟾素處理組；G1～G4.分別為壞死細胞、晚期凋亡細胞、正常細胞、早期凋亡細胞所占百分比；E.各組調(diào)亡率比較。圖5 華蟾素對MDA-MB-231細胞凋亡率的影響

注：A.蛋白表達條帶；B.表達水平比較。圖6 華蟾素對Bax、Bcl-2、PTHrP、Cleaved capsase-3和Cleaved caspase-9表達的影響

研究證明，華蟾素對多種腫瘤如肝癌、胃癌、骨肉瘤、乳腺癌等有抑制作用。孫宇等[14]研究證明，華蟾素能顯著抑制人肝癌細胞HepG-2增殖，誘導(dǎo)其凋亡，可能與華蟾素下調(diào)腫瘤細胞TopoⅠ、TopoⅡ表達有關(guān)。殷文謹(jǐn)?shù)萚15]研究表明，華蟾素能抑制乳腺癌細胞增殖，降低其侵襲能力，并通過下調(diào)Cyclin A1、D1等細胞周期中的正向調(diào)節(jié)因子及促進P21等負向調(diào)節(jié)因子的表達進而抑制細胞周期進程。本研究基于華蟾素的抗腫瘤作用，研究其對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、凋亡的影響及其機制，并初步探討華蟾素對PTHrP表達的影響，為后續(xù)進一步研究提供基礎(chǔ)。

本研究應(yīng)用不同質(zhì)量濃度的華蟾素(0、10、20、40、60、80 μg·mL-1)處理MDA-MB-231細胞48 h，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及密度變化，結(jié)果表明華蟾素處理組中，細胞皺縮變圓，貼壁能力降低，并且隨著華蟾素質(zhì)量濃度的增加，細胞數(shù)量及密度明顯減少，說明華蟾素能抑制MDA-MB-231細胞的增殖。為進一步驗證華蟾素對MDA-MB-231細胞的毒性作用，我們進行了CCK-8實驗，結(jié)果表明華蟾素可以時間、濃度依賴性抑制MDA-MB-231細胞的增殖。隨后，我們研究了華蟾素對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響，劃痕結(jié)果表明，對照組中細胞生長明顯，劃痕接近愈合，而華蟾素處理組中隨著華蟾素濃度的增加，劃痕愈合趨勢越來越不明顯，說明華蟾素對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移能力有較為明顯的抑制作用。

由于細胞增殖受限與細胞凋亡密切相關(guān)，我們隨后檢測了華蟾素對MDA-MB-231細胞凋亡率的影響。FITC/PI雙染流式細胞術(shù)結(jié)果表明MDA-MB-231細胞凋亡率隨著華蟾素質(zhì)量濃度的增加而顯著提高，說明華蟾素能顯著誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡。細胞凋亡又稱為細胞程序性死亡，經(jīng)典的細胞凋亡途徑主要包括：線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑[16]，均依賴于Csapase級聯(lián)反應(yīng)來誘導(dǎo)。在線粒體凋亡途徑中，當(dāng)細胞受到凋亡信號刺激后，線粒體外膜通透性增加，線粒體內(nèi)的凋亡因子，如細胞色素C(Cytochrome，Cytc)等釋放到細胞質(zhì)，與凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1(Apoptotic protease activating facter-1)結(jié)合，進而活化Caspase9，進一步激活Caspase3，從而導(dǎo)致Csapase級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生以誘導(dǎo)細胞凋亡，而定位于線粒體膜上的Bcl-2家族蛋白如促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2可通過調(diào)控Cytc的釋放從而調(diào)控細胞凋亡[17]。為了探究華蟾素誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡的分子機制，我們檢測了華蟾素對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響。結(jié)果表明，華蟾素處理組中促凋亡蛋白Bax表達水平上調(diào)，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達水平則顯著下降。Bax與Bcl-2蛋白表達水平失衡，引起線粒體膜通透性改變，從而引起線粒體凋亡通路級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。華蟾素處理組中Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的高表達也驗證了這一通路的激活。表明華蟾素通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡。

此外，Western Blot結(jié)果表明華蟾素可以抑制MDA-MB-231細胞中PTHrP的表達。正常生理情況下，RANK/RANKL-OPG系統(tǒng)能調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的活性平衡，使成骨細胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收處于平衡狀態(tài)，而在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細胞通過分泌PTHrP、IL-1等活性因子導(dǎo)致溶骨性骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[18-20]。本研究證實，華蟾素可以抑制MDA-MB-231細胞中PTHrP的表達，由此，我們假設(shè)華蟾素可通過下調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細胞中PTHrP進而抑制溶骨性骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，這有待于后續(xù)的動物實驗來進行驗證。

綜上所述，華蟾素能抑制MDA-MB-231細胞增殖，降低其遷移能力，并通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞凋亡?？傊覀兊难芯勘砻?，華蟾素能在一定程度上對三陰性乳腺癌產(chǎn)生抑制作用，至于能否抑制乳腺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，有待后續(xù)進一步驗證。

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