高學(xué)忠，黃隱青，林 叢，黃亦煒，張 鑫，吳連拼

長(zhǎng)期大量飲酒，攝入體內(nèi)的酒精及其代謝產(chǎn)生毒性更為巨大的乙醛等對(duì)心臟產(chǎn)生毒害作用，使心肌代謝和組織學(xué)異常，導(dǎo)致心肌變形、心臟擴(kuò)大、心肌收縮力降低，心功能下降，臨床上稱之為酒精性心肌病(alcohol cardiomyopathy，ACM)[1]。隨著現(xiàn)代飲酒人數(shù)的逐漸增多，飲酒量的加大，ACM的發(fā)病率也逐年上漲[2]。酒精對(duì)心臟的損害已成為威脅人類健康的世界性問題，越來(lái)越受到關(guān)注，但ACM的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚。

自噬(autophagy)是將機(jī)體內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w內(nèi)進(jìn)行消化降解的動(dòng)態(tài)過程，是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制[3]。正常水平的自噬對(duì)心臟的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但自噬過度和自噬不足卻可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。此外，大量文獻(xiàn)表明自噬在多種心血管疾病中都扮演著重要的作用，如心肌缺血、再灌注、心肌肥大、糖尿病心肌病等均可誘導(dǎo)心肌內(nèi)自噬水平增強(qiáng)[4，5]。因此自噬在不同的病理?xiàng)l件下，扮演著不同的角色，需要進(jìn)一步的研究確認(rèn)。而在慢性酒精心肌病的發(fā)生和發(fā)展過程中，自噬的研究卻很少涉及。本研究通過建立小鼠酒精心肌病模型，觀察心肌自噬的變化，旨在探討自噬對(duì)酒精心肌病的作用以及人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)介導(dǎo)的自噬的發(fā)生機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器：40只雄性C57BL/6小鼠，12周齡(溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；酒精飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)；TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche公司。3_Methyladenine和SF1670試劑購(gòu)自Sigma_Aldrich公司；PTEN抗體、LC3A/B抗體、p_mTOR抗體、mTOR抗體、β_actin抗體購(gòu)自Abcam公司；AKT抗體、p_AKT抗體、p_s6抗體、s6抗體、cleaved Caspase_3抗體購(gòu)自CST公司；熒光二抗驢抗兔IgG購(gòu)自Invitrogen公司；激光共聚焦顯微鏡(日本Niko公司)；Vevo7701型超聲心動(dòng)儀(加拿大公司)。

1.2 方法：

1.2.1 小鼠分組：40只雄性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為四組，分別為對(duì)照組(Con)、慢性酒精心肌病組(EtOH)、慢性酒精心肌病+3_MA組及慢性酒精心肌病+PTEN抑制劑(SF1670)組，每組各10只。

1.2.2 小鼠慢性酒精心肌病模型的構(gòu)建：對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)8周的含有4%(vol/vol)酒精飼料喂養(yǎng)[6]。對(duì)照小鼠用普通等量飼料喂養(yǎng)。連續(xù)喂養(yǎng)8周后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。

1.2.3 小鼠心臟功能檢測(cè)：對(duì)照小鼠和給藥小鼠，按照60mg/kg的比例，腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉麻醉。應(yīng)用高分辨的彩色多普勒超聲心動(dòng)圖分析小鼠心功能(Vevo 7701；Canada)。檢測(cè)射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)，以上數(shù)值均連續(xù)檢測(cè)5個(gè)心動(dòng)周期，計(jì)算平均值。

1.2.4 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用TUNEL染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況[9]。

1.2.5 提取心肌總蛋白：各心臟樣品取出后，置于研缽中，加入液氮，在低溫下迅速碾磨至粉末狀，加一定量的組織總蛋白提取裂解液，4℃靜置3h，置于超聲細(xì)胞破碎儀中破碎細(xì)胞，15000rpm，4℃，15min離心，提取上清。

1.2.6 心臟LC3_II免疫熒光檢測(cè)：各組小鼠心臟于4%的多聚甲醛固定24小時(shí)，置于20%的蔗糖脫水24小時(shí)，30%的蔗糖脫水24小時(shí)。用OCT包埋，包埋塊固定于冰凍切片機(jī)上，調(diào)整切片厚度，6μm切片，制片。用LC3_II抗體4℃孵育過夜，然后用熒光二抗37℃孵育2小時(shí)，于共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 Western blot提取各組心肌組織蛋白，BCA蛋白定量后，對(duì)樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜和化學(xué)發(fā)光，條帶掃描后應(yīng)用Quantity one軟件半定量分析蛋白條帶的灰度值，相對(duì)表達(dá)量以各蛋白條帶與對(duì)應(yīng)β_actin條帶灰度計(jì)算比值，評(píng)估目的蛋白的表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1 慢性酒精刺激會(huì)促進(jìn)C57BL/6小鼠心肌自噬的發(fā)生，誘導(dǎo)心肌凋亡：小鼠用酒精飼料連續(xù)喂養(yǎng)8周后，然后通過免疫印跡方法檢測(cè)心肌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3_II的表達(dá)水平。和對(duì)照組小鼠相比，酒精刺激能夠顯著上調(diào)LC3_II的蛋白表達(dá)量(圖1A，1B)。我們進(jìn)一步使用免疫熒光染色方法對(duì)自噬進(jìn)行檢測(cè)，LC3_II的紅色熒光斑點(diǎn)的積累也表明了酒精刺激能夠促進(jìn)小鼠心肌自噬的發(fā)生(圖1D，1E)。此外，與對(duì)照小鼠相比，酒精組心肌內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase_3(c_CAS_3)的表達(dá)量也有顯著的增加，說明酒精刺激能夠誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。

2.2 自噬的激活緩解酒精刺激引起的心功能下降和細(xì)胞凋亡：酒精刺激能夠誘導(dǎo)自噬的激活，但自噬在不同疾病中發(fā)揮著不同的作用。為了確定自噬的激活在酒精性心肌病中的作用，我們利用自噬的抑制劑3_MA，按照10mg/kg劑量，每周腹腔注射一次。結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，酒精組小鼠心功能有所下降，同時(shí)射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)都有所下調(diào)，而當(dāng)共同作用3_MA和酒精的小鼠，心功能損傷的更為明顯，EF、FS進(jìn)一步下降(圖2A_C)。酒精刺激能夠誘導(dǎo)c_CAS_3蛋白的表達(dá)量增加，共同作用3_MA和酒精的小鼠，c_CAS_3的蛋白表達(dá)量也進(jìn)一步的上調(diào)，表明細(xì)胞凋亡增加(圖2D，2E)。由此說明酒精刺激誘導(dǎo)的自噬激活對(duì)酒精性心肌病具有保護(hù)作用。

圖1 慢性酒精刺激誘導(dǎo)心肌自噬發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡 注：A：Western blot的檢測(cè)小鼠心肌組織LC3_II、c_CAS_3蛋白表達(dá)水平；B：LC3_II的表達(dá)量；C：c_CAS_3的表達(dá)量；D：免疫熒光檢測(cè)自噬的發(fā)生；E：LC3陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。與Con比較*P<0.01

圖2 自噬在酒精引起的心功能紊亂中起到保護(hù)作用 注：A：各組小鼠的心功能示意圖；B各組小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)；C：各組小鼠心臟縮短分?jǐn)?shù)；D：Western blot的檢測(cè)小鼠心肌組織c_CAS_3蛋白表達(dá)水平；E：c_CAS的表達(dá)量。與Con比較*P<0.05，**P<0.01；與EtOH比較#P<0.05

2.3 慢性酒精刺激上調(diào)PTEN蛋白的表達(dá)量：免疫印跡技術(shù)表明在慢性酒精刺激下，小鼠心臟內(nèi)的PTEN蛋白表達(dá)水平有明顯地增加(圖3A，3B)，PTEN表達(dá)的增加對(duì)AKT/mTOR有著進(jìn)一步的負(fù)調(diào)控作用，AKT和mTOR的磷酸化水平下降(圖3A，3C，3D)，s6是mTOR的下游，其磷酸化水平也有顯著下降(圖3E)。

圖3 慢性酒精刺激引起小鼠心臟內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)量上調(diào) 注：A：Western blot的檢測(cè)小鼠心肌組織PTEN、p_AKT/AKT、p_mTOR/mTOR、p_s6/s6以及β_actin蛋白表達(dá)水平；B：PTEN的表達(dá)量；C：p_AKT/AKT的比值；D：p_mTOR/mTOR的比值；E：p_s6/s6的比值。與Con比較*P<0.01

2.4 慢性酒精刺激誘導(dǎo)的自噬上調(diào)主要由PTEN調(diào)控：為了探究PTEN在酒精誘導(dǎo)的自噬中的作用，我們利用PTEN的抑制劑SF1670，按照3mg/kg，每周皮下注射3次，8周后檢測(cè)自噬的變化。與單純作用酒精小鼠相比，共同作用酒精和SF1670的小鼠心肌內(nèi)PTEN的表達(dá)量下調(diào)至正常水平，同時(shí)AKT、mTOR、s6的磷酸化水平也回升了。進(jìn)一步檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3_II的表達(dá)量，作用SF1670可以顯著下調(diào)酒精刺激誘導(dǎo)的LC3_II表達(dá)量的增加，抑制自噬的發(fā)生。由此說明PTEN在酒精刺激誘導(dǎo)的自噬中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

2.5 PTEN的抑制進(jìn)一步加劇心肌細(xì)胞凋亡：為了證明PTEN活性對(duì)酒精引起的心臟功能損傷和心肌細(xì)胞凋亡具有作用，我們研究了SE1670在酒精刺激的小鼠心肌中的作用。通過檢測(cè)c_CAS_3蛋白表達(dá)水平(圖5A，5B)、TUNEL實(shí)驗(yàn)(圖5C)得到結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SF1670在抑制自噬激活情況下，明顯加劇了酒精引起心肌細(xì)胞的凋亡。

圖4 PTEN介導(dǎo)酒精刺激誘導(dǎo)的自噬 注：A：Western blot的檢測(cè)小鼠心肌組織PTEN、p_AKT/AKT、p_mTOR/mTOR、p_s6/s6蛋白表達(dá)水平；B：PTEN的表達(dá)量；C：p_AKT/AKT的比值；D：p_mTOR/mTOR的比值；E：p_s6/s6的比值；F：Western blot的檢測(cè)小鼠心肌組織LC3_II；G：LC3_II的表達(dá)量。與Con比較*P<0.01；與EtOH比較#P<0.01

圖5 PTEN的上調(diào)在酒精引起的細(xì)胞凋亡中起到保護(hù)作用 注：A：Western blot的檢測(cè)小鼠心肌組織c_CAS_3；B：c_CAS_3的表達(dá)量；C：TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡；D：TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。與Con比較*P<0.01；與EtOH比較#P<0.01

3 討論

慢性酒精性心肌病發(fā)病率、死亡率逐年增高，已經(jīng)成為21世紀(jì)嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。酒精性心肌病的發(fā)病機(jī)制可能包括細(xì)胞壞死和凋亡、細(xì)胞器損傷、心肌收縮蛋白功能變化、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應(yīng)激以及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂等，但是確切機(jī)制尚無(wú)定論[7]。本研究采用酒精飼料喂養(yǎng)，使小鼠對(duì)酒精產(chǎn)生依賴，飼養(yǎng)8周后心臟超聲顯示小鼠心腔普遍擴(kuò)大，心室壁變薄，心臟的收縮功能明顯降低，小鼠心臟EF、FS都有顯著的降低，說明慢性酒精刺激造成了心臟結(jié)構(gòu)及功能受損。

心肌自噬是在生理和病理?xiàng)l件下普遍存在的生命現(xiàn)象，在心臟疾病的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用，自噬在心血管應(yīng)激和心臟疾病中都扮演著重要角色。然而，自噬在慢性酒精引起的心肌功能失調(diào)和心肌細(xì)胞凋亡中的確切作用仍是不清楚的。本研究證實(shí)了，3_MA抑制自噬都會(huì)加劇酒精引起的心臟功能失調(diào)和心肌細(xì)胞凋亡。

自噬的發(fā)生在不同病理?xiàng)l件下受到不同的信號(hào)通路影響而發(fā)揮不同的作用。研究指出，mTOR在自噬通路中起重要的調(diào)控作用。在營(yíng)養(yǎng)、能量充足的情況下，mTORC1能使ULK1(自噬相關(guān)基因1同系物)的757絲氨酸位點(diǎn)磷酸化，抑制ULK1的活性，從而抑制AMPK和ULK1的作用，抑制自噬的發(fā)生[8]。另外，mTOR上游PI3K/AKT在心臟疾病中也發(fā)揮著重要角色，小鼠擴(kuò)張型心肌病的模型中發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可延長(zhǎng)患有擴(kuò)張型心肌病小鼠的壽命，主要原因是由于心肌PI3K被激活，自噬抑制所致。相反，心肌中PI3K的活性降低，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生會(huì)明顯加速心衰的進(jìn)程，說明PI3K對(duì)維持心臟的結(jié)構(gòu)和功能起重要作用[9]。PTEN是脂質(zhì)磷酸酶，可通過特異性地促使PIP3的脫磷酸化，使之轉(zhuǎn)化為PIP2，致使PIP3不能激活下游的AKT，從而抑制AKT的活性。相關(guān)文獻(xiàn)也報(bào)道，PTEN可通過對(duì)PI3K/AKT/mTOR的抑制對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)控[9，10]。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，在酒精刺激下，心肌內(nèi)的PTEN蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，與此同時(shí)，AKT/mTOR/s6的磷酸化水平下調(diào)，當(dāng)作用PTEN抑制劑SF1670后，情況出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，同時(shí)LC3_II的表達(dá)量也下調(diào)，抑制自噬，進(jìn)一步增加細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們的研究證明了慢性酒精刺激激活自噬發(fā)生，對(duì)慢性酒精刺激引起的心臟毒性起到一定的保護(hù)作用，自噬的激活主要通過PTEN來(lái)調(diào)控的，有可能在今后為慢性酒精心肌病患者的治療提供一種新的思路。

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