董曉巧，俞文華，杜 權(quán)，王 昊，楊定博，沈永鋒，江 力，杜垣峰，朱 強(qiáng)

免疫反應(yīng)是蛛網(wǎng)膜下腔出血后繼發(fā)性腦損傷病理生理機(jī)制的重要組成部分[1,2]。FTY720是一種新型的免疫抑制劑，對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答具有雙向調(diào)節(jié)作用，抑制免疫反應(yīng)的同時(shí)并不破壞機(jī)體對(duì)病毒的免疫應(yīng)答和免疫記憶能力[3～5]。FTY720已經(jīng)在臨床上用于治療多發(fā)性硬化癥及器官移植后的排斥反應(yīng)[6,7]。FTY720腹腔注射可以抑制顱腦損傷大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善大鼠神經(jīng)功能[8,9]。FTY720腹腔注射也可以抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠腦炎癥反應(yīng)，改善大鼠認(rèn)知功能[10]。迄今，鮮見揭示FTY720神經(jīng)保護(hù)的劑量-藥效關(guān)系相關(guān)報(bào)道。本研究使用不同劑量FTY720腹腔注射治療大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血，觀察其對(duì)腦損傷大鼠海馬組織炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡及神經(jīng)功能的影響，探討FTY720神經(jīng)保護(hù)作用的劑量-藥效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料：健康Wistar大鼠(南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，雄性，清潔級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(蘇)2005_0003，使用許可證SYXK(蘇)2005_0004)；Morris水迷宮(型號(hào)：XR_XM101，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；FTY720(規(guī)格：25mg，批號(hào)：SML0700，美國(guó)Sigma公司)；酶標(biāo)儀(型號(hào)：MK3，美國(guó)Thermo Scientific公司)；低溫高速離心機(jī)(型號(hào)：BECKMAN，北京普瑞麥迪實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)；熒光分光光度儀(型號(hào)：UV_1202，日本島津公司)；腫瘤壞死因子_α酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號(hào)：MTA00B，美國(guó)R&D公司)，白介素_1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號(hào)：M6000B，美國(guó)R&D公司)，白介素_6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號(hào)：MLB00C，美國(guó)R&D公司)。

1.2 方法：將48只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、小劑量組和大劑量組，每組12只。大鼠予50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，采用Roux等[11]建立的枕大池二次注血法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型。假手術(shù)組和模型組大鼠予以1ml 0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，小劑量組和大劑量組大鼠模型形成前0.5h分別予以FTY720 1mg/kg和5mg/kg劑量腹腔注射。24h后，取各組6只大鼠以80mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，斷頭處死，分離海馬組織，用于炎癥和細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定；各組其余6只大鼠用于神經(jīng)功能的評(píng)估。大鼠模型形成后，假手術(shù)組大鼠死亡1只，模型組大鼠死亡3只，小劑量組大鼠死亡2只，大劑量組大鼠死亡1只。大鼠死亡后補(bǔ)充成活大鼠，保證每組12只大鼠。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，四組大鼠死亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.80，P>0.05)。

1.3 海馬組織炎癥和細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)測(cè)定：取部分海馬組織制作勻漿，離心后采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定上清液腫瘤壞死因子_α、白介素_1β和白介素_6水平：將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本各50μl依次加入孔中，并做好標(biāo)記；37℃溫育30min后，棄去孔內(nèi)液體，洗板5次；在各孔中分別加入50μl酶標(biāo)試劑，37℃溫育30min后，棄去孔內(nèi)液體，洗板5次；在各孔中分別加入100μL顯色試劑，37℃避光孵育10min后，每孔加終止液50μL，充分混勻，終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定OD值，結(jié)果表示為pg/mg腦組織。取部分海馬組織制作勻漿，采用四肽熒光底物法檢測(cè)caspase_3和caspase_9蛋白活性。取100μl腦組織勻漿和10μl caspase_3或caspase_9底物，加入緩沖液至1ml，37℃孵育1h。用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)380nm或400nm，釋放波長(zhǎng)460nm或505nm處測(cè)定樣本熒光強(qiáng)度，以未加腦組織時(shí)的熒光強(qiáng)度為參照值，計(jì)算熒光強(qiáng)度，最終比較相對(duì)熒光強(qiáng)度，間接反應(yīng)caspase_3和caspase_9蛋白活性。

1.4 大鼠神經(jīng)功能評(píng)價(jià)：參照Vorhees等[12]的方法，在腦損傷后第8、9、10、11和12天對(duì)大鼠進(jìn)行Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠逃避潛伏期，用于反映大鼠的學(xué)習(xí)能力，從而評(píng)價(jià)大鼠的認(rèn)知功能。將大鼠面向池壁分別從兩個(gè)象限的入水點(diǎn)放入水中，記錄其在120s內(nèi)尋找到平臺(tái)的時(shí)間，即為逃避潛伏期。如果大鼠120s內(nèi)不能找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者用手牽引其到平臺(tái)上停留10s，再放回到籠中，記錄時(shí)間120s。Chen等[13]的方法，在腦損傷后第14、15、16、17和18天測(cè)定大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分，包括運(yùn)動(dòng)、感覺、反射和平衡試驗(yàn)，最低分為0，最高分為18分，分值越高神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

2 結(jié)果

2.1 FTY720對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響：在蛛網(wǎng)膜下腔出血后第8、9、10、11和12各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，四組大鼠逃避潛伏期組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；且組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。采用重復(fù)測(cè)量方差分析，考慮腦損傷后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，四組大鼠逃避潛伏期組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=308.86，P<0.01)，且模型組逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于假手術(shù)組(P<0.05)，小劑量組逃避潛伏期較模型組顯著縮短(P<0.05)，大劑量組逃避潛伏期較小劑量組顯著縮短(P<0.05)，見表1。

表1 FTY720對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后逃避潛伏期的影響

2.2 FTY720對(duì)大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分的影響：假手術(shù)組大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分均為最低分，即為0分。在蛛網(wǎng)膜下腔出血后第14、15、16、17和18各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組、小劑量組和大劑量組三組大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；且組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。采用重復(fù)測(cè)量方差分析，考慮腦損傷后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，三組大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=74.32，P<0.01)，且小劑量組大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分較模型組顯著降低(P<0.05)，大劑量組大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分較小劑量組顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 FTY720對(duì)大鼠改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分的影響

2.3 FTY720對(duì)大鼠海馬組織炎性因子水平及凋亡相關(guān)蛋白活性的影響：四組大鼠海馬組織白介素_1β、腫瘤壞死因子_α和白介素_6水平及caspase_3和caspase_9蛋白活性組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，且模型組較假手術(shù)組大鼠海馬組織白介素_1β、腫瘤壞死因子_α和白介素_6水平及caspase_3和caspase_9蛋白活性均顯著升高(均P<0.05)，小劑量組較模型組大鼠海馬組織白介素_1β、腫瘤壞死因子_α和白介素_6水平及caspase_3和caspase_9蛋白活性均顯著降低(均P<0.05)，大劑量組較小劑量組大鼠海馬組織白介素_1β、腫瘤壞死因子_α和白介素_6水平及caspase_3和caspase_9蛋白活性均顯著降低(均P<0.05)，見表3。

表3 FTY720對(duì)大鼠海馬組織炎性因子水平及凋亡相關(guān)蛋白活性的影響

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血是一種重要的腦損傷形式，可引發(fā)腦血管痙攣、腦缺血和神經(jīng)功能障礙，甚至造成患者死亡[14,15]。腦動(dòng)脈瘤破裂是蛛網(wǎng)膜下腔出血的主要原因，目前的醫(yī)療手段可有效地處理絕大部分腦動(dòng)脈瘤，但對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血造成的早期腦損傷卻缺乏有效的治療方法。免疫反應(yīng)參與蛛網(wǎng)膜下腔出血后繼發(fā)性腦損傷過程[1,2]，抑制免疫反應(yīng)對(duì)減少繼發(fā)性腦損傷有著重要的作用。但臨床常規(guī)使用的免疫抑制劑可導(dǎo)致全身免疫功能低下，繼發(fā)感染。因此尋找一種安全有效的免疫抑制劑對(duì)于降低蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦損傷有著重要意義。

FTY720由冬蟲夏草抽提物中具有免疫抑制作用的ISP_I進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造而成的，屬于鞘氨醇_1_磷酸鹽受體阻滯劑。FTY720作為一種新型的免疫抑制劑，在體外以無活性的形式存在，在體內(nèi)需經(jīng)鞘氨醇激酶2磷酸化而轉(zhuǎn)化為具有生物活性的FY720異構(gòu)體而發(fā)揮作用[3～5]。目前，F(xiàn)TY720在臨床上主要用于治療肝腎器官移植后的排斥反應(yīng)及皮炎、重癥肌無力等免疫紊亂/障礙疾病[6,7]。

FTY720用于腦損傷治療方面的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)展很快。FTY720可有效地阻止體外培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子[16]，顯著抑制顱腦損傷大鼠腦皮層炎性細(xì)胞聚集和炎癥因子釋放[17]，明顯抑制動(dòng)物腦出血后腦內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720可以有效抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬組織白介素_1β、腫瘤壞死因子_α和白介素_6的分泌。這些數(shù)據(jù)說明，F(xiàn)TY720可有效地抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血繼發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)TY720可顯著降低顱腦損傷大鼠海馬組織caspase_3和caspase_9蛋白活性，抑制顱腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提高腦損傷大鼠的肢體運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能[8,9]；FTY720也可改善短暫性腦缺血和腦出血大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能[19,20]。本研究證實(shí)，F(xiàn)TY720可顯著抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬組織caspase_3和caspase_9蛋白活性，縮短逃避潛伏期，改善大鼠的認(rèn)知功能，提高改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分，改善神經(jīng)功能缺損。這些研究結(jié)果提示，F(xiàn)TY720可有效地抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)功能。

既往的絕大部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均使用1mg/kg FTY720腹腔注射用于治療腦出血、腦缺血、腦外傷和蛛網(wǎng)膜下腔出血[8～10,19,20]。但少有研究揭示FTY720治療腦損傷的劑量和藥效關(guān)系。本研究選擇了FTY720 1mg/kg和5mg/kg兩種劑量腹腔注射用于治療大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)TY720腹腔注射可劑量依賴性地抑制大鼠海馬組織白介素_1β、腫瘤壞死因子_α和白介素_6釋放及caspase_3和caspase_9蛋白活性，同時(shí)明顯改善蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠的認(rèn)知功能和神經(jīng)功能缺損。這些現(xiàn)象說明，F(xiàn)TY720對(duì)恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。由于FTY720本身具有免疫功能抑制作用，而抑制炎癥反應(yīng)降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡與改善神經(jīng)功能具有必然的聯(lián)系[21～23]。因此，F(xiàn)TY720改善蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠神經(jīng)功能可能與其抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)及降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，而且這種效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴性。FTY720對(duì)腦損傷作用的更多著落點(diǎn)并非其作用于免疫系統(tǒng)，而是穩(wěn)定地穿過血腦屏障，直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的1_磷酸鞘氨醇受體，能通過上調(diào)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)、下調(diào)凋亡基因表達(dá)、受體激活或功能性內(nèi)化等方式對(duì)中樞內(nèi)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、微血管產(chǎn)生生物調(diào)節(jié)作用[24,25]。因此，在解釋FTY720對(duì)腦損傷保護(hù)的機(jī)制方面需要保持謹(jǐn)慎態(tài)度。

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