左秀玲，王志宏，陳海燕

鄭州市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，鄭州 450004

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，其中乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）是其最主要的病理類型，占甲狀腺癌的80%[1]。PTC早期患者（Ⅰ～Ⅱ期）的5年生存率可達(dá)100%，Ⅲ期患者約為93%，而Ⅳ期患者僅為51%[2-4]；因此，PTC患者的早期診斷對(duì)增加其生存率十分重要。甲狀腺癌相關(guān)腫瘤分子標(biāo)志物是早期診斷的重要指標(biāo)。有研究證實(shí)，多種腫瘤標(biāo)志物與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-6]，其中促甲狀腺激素受體（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）是甲狀腺組織的特異性標(biāo)志物，在甲狀腺功能和甲狀腺細(xì)胞生長過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用；然而，已有的研究多集中于TSHR蛋白在甲狀腺癌組織中的作用，而其在PTC外周血中基因表達(dá)變化的研究相對(duì)較少，且多采用術(shù)后組織病理標(biāo)本進(jìn)行腫瘤標(biāo)志物檢測，達(dá)不到早期鑒別診斷的目的。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，體外檢測PTC患者的外周血TSHR mRNA表達(dá)水平，探討其在PTC鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值，并分析TSHR mRNA表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系，為PTC的研究提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年1月至2016年6月鄭州市第一人民醫(yī)院確診的50例PTC患者作為觀察組，同期40例于鄭州市第一人民醫(yī)院體檢的健康體檢者作為對(duì)照組。觀察組患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均于術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診；②臨床資料完整；③初次手術(shù)；④術(shù)前未經(jīng)放化療和生物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、肝、腎功能不全；②伴其他惡性腫瘤。觀察組50例患者中，男18例，女32例；年齡為26～75歲，平均為（43.4±8.2）歲；TNM分期：Ⅰ期有9例，Ⅱ期有12例，Ⅲ期有16例，Ⅳ期有13例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例。對(duì)照組40例受試者中，男16例，女24例；年齡為25～76歲，平均為（44.1±8.1）歲。兩組受試者的年齡和性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經(jīng)鄭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有受試者均簽署本研究的知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集與總RNA提取 采集觀察組患者術(shù)前和對(duì)照組受試者清晨空腹外周靜脈血5 ml，立即應(yīng)用Trizol試劑（購于美國Sigma Aldrich公司）從受試者全血中提取總RNA。將提取的總RNA加入 20 μl水中溶解，測光密度（optical density，OD）值。當(dāng)OD260/OD280≥1.8時(shí)，可用于后續(xù)研究。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購于日本Takara公司）的說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用SYBR Green（購于日本Takara公司）染色，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。利用ABI7500系統(tǒng)（購于美國Applied Biosystems公司），按照制造商提供的方案在含1 μg cDNA的25 μl反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，所有反應(yīng)均重復(fù)3次。以β-actin作為內(nèi)參，目的基因TSHRmRNA和內(nèi)參β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，引物序列如下：TSHR，F(xiàn)orward 5'-GCTTTTCAGGGACTATGCAATGAA-3'，Reverse 5'-AAGGGCAGTGACACTGGTTTGAGA-3'；β -actin，F(xiàn)orward 5'-CCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3'，Reverse 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA-3'。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的條件：95℃下10 s，95℃下5 s，57.5℃下20 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSHR mRNA的表達(dá)水平

觀察組50例患者的外周血TSHR mRNA的平均表達(dá)水平為（1.82±0.28），明顯高于對(duì)照組40例受試者的（1.01±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.192，P﹤0.01）。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果

TSHR和β-actin基因的熔解曲線均顯示單峰，無引物二聚體形成，提示反應(yīng)體系良好，無污染物干擾；擴(kuò)增曲線顯示引物質(zhì)量良好，PCR產(chǎn)物未出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物。（圖1）

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果

2.3 TSHR mRNA表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

PTC患者的外周血TSHR mRNA表達(dá)水平在性別、年齡、腫瘤直徑方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；PTCⅢ～Ⅳ期患者的TSHR mRNA表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.381，P﹤0.01）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的TSHR mRNA表達(dá)水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.453，P﹤0.01）。（表1）

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有準(zhǔn)確性高和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)研究，僅需少量的外周血即可進(jìn)行研究，可消除其他基因的干擾。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測PTC患者外周血樣本中TSHR mRNA的表達(dá)水平，分析其與臨床特征的關(guān)系，探討TSHR mRNA在PTC診斷中的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)熔解曲線顯示為單峰時(shí)，證明實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物特異性高，無二聚體，且無其他非特異性擴(kuò)增。本研究中TSHR mRNA的熔解曲線為單峰，且為避免基因組DNA對(duì)研究結(jié)果的干擾，本研究所有目的基因和內(nèi)參基因引物擴(kuò)增產(chǎn)物的長度均為90～150 bp，擴(kuò)增效率相近，證明本研究的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

表1 PTC患者外周血TSHR mRNA表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系

促甲狀腺激素與其受體TSHR是調(diào)控甲狀腺功能的關(guān)鍵蛋白。正常情況下TSH與TSHR結(jié)合后可以激活腺苷酸環(huán)化酶和磷酸酯酶C，進(jìn)而通過環(huán)磷酸腺苷、乙酰甘油和1，4，5-三磷酸肌醇傳遞信號(hào)，從而刺激甲狀腺細(xì)胞生長，并參與調(diào)節(jié)甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，Tg）、甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）和鈉碘轉(zhuǎn)動(dòng)體（sodium iodide symporter，NIS）等表達(dá)，其中 TSHR在甲狀腺的調(diào)控中起主導(dǎo)作用。已有研究證實(shí)，在正常的甲狀腺細(xì)胞和癌細(xì)胞中均有TSHR表達(dá)，其表達(dá)水平存在差異[7]。王朝暉等[8]的研究顯示，應(yīng)用免疫組化法檢測PTC組織和正常甲狀腺組織標(biāo)本中TSHR蛋白表達(dá)情況，PTC組織中TSHR蛋白表達(dá)高于正常甲狀腺組織，這可能是甲狀腺癌發(fā)生的早期標(biāo)志。這些研究表明，TSHR可以作為診斷PTC的生物標(biāo)志物。

過往研究多集中于甲狀腺癌根治術(shù)后腫瘤組織中TSHR蛋白表達(dá)的變化，而外周血中其基因表達(dá)變化的研究較少。Ishikawa等[9]在甲狀腺癌患者的外周血中發(fā)現(xiàn)了甲狀腺細(xì)胞，且TSHR mRNA表達(dá)異常。Torosian等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，正常人外周血中存在少量的甲狀腺細(xì)胞。血液中TSHR mRNA的表達(dá)與循環(huán)中的癌細(xì)胞TSHR mRNA高表達(dá)有關(guān)[11]。這些研究表明，可以通過外周血甲狀腺細(xì)胞中目的基因的變化情況診斷甲狀腺疾病。本研究對(duì)外周血單核細(xì)胞中TSHR mRNA進(jìn)行相對(duì)定量檢測發(fā)現(xiàn)，PTC患者和健康受試者的外周血中均發(fā)現(xiàn)TSHR mRNA表達(dá)，且PTC患者的TSHR mRNA表達(dá)水平明顯高于健康受試者，提示外周血細(xì)胞中TSHR mRNA表達(dá)水平升高與甲狀腺病變有關(guān)。

劉翔和高明[12]采用免疫組化法檢測侵襲性PTC患者腫瘤組織中TSHR蛋白表達(dá)情況，低分化、高侵襲性、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中TSHR蛋白表達(dá)水平明顯降低，且其表達(dá)水平與腫瘤惡性程度呈明顯負(fù)相關(guān)。許少偉等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，PTC原發(fā)病灶中TSHR表達(dá)水平與患者的年齡、性別、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)，外周血TSHR mRNA的表達(dá)水平與PTC患者的年齡、性別、腫瘤直徑無關(guān)，與之前研究一致；然而，本研究中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的外周血TSHR mRNA表達(dá)水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P﹤0.01），推測發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其PTC癌細(xì)胞的侵襲性相對(duì)較強(qiáng)，更易于從組織中脫落而進(jìn)入外周血，使外周血中甲狀腺細(xì)胞數(shù)量增加，從而使TSHR mRNA表達(dá)水平升高。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ～Ⅱ期PTC患者外周血TSHR mRNA表達(dá)水平明顯低于Ⅲ～Ⅳ期患者（P﹤0.01），提示TSHR mRNA表達(dá)水平升高與PTC進(jìn)展有關(guān)。

綜上所述，外周血中TSHR mRNA表達(dá)水平升高與甲狀腺病變有關(guān)，且與患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。本研究中所選取的樣本數(shù)量較少，且未同時(shí)研究其他TSHR相關(guān)生物標(biāo)志物在PTC中的表達(dá)變化情況，在后續(xù)研究中需要進(jìn)一步補(bǔ)充。

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