王艷春，于呈偉，齊穎會(huì)，劉振來

朝陽市第二醫(yī)院1呼吸內(nèi)科，2心胸外科，遼寧 朝陽 122000

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，近幾年肺癌的發(fā)病率持續(xù)上升，病死率居高不下，嚴(yán)重威脅著人類健康[1-2]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的80%左右，且發(fā)病率和病死率持續(xù)上升[3]。肺癌在早期并無明顯癥狀，大多數(shù)患者僅會(huì)出現(xiàn)一些常見的呼吸道癥狀，如咳嗽、胸悶等，大部分患者在就診時(shí)已處于晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致患者的5年生存率大大降低[4]。盡早發(fā)現(xiàn)、及時(shí)診斷、盡快治療是降低肺癌病死率的根本方法。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（miRNA）在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[5]。已有研究證實(shí)，微小RNA-21（miRNA-21）與甲狀腺乳頭狀癌、肝癌等多種惡性腫瘤存在一定的相關(guān)性[6]。本研究通過檢測(cè)miRNA-21在NSCLC患者中的表達(dá)水平，并探討其與細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物水平的相關(guān)性，旨在為NSCLC的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年1月至2017年9月于朝陽市第二醫(yī)院接受治療的80例NSCLC患者作為NSCLC組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②通過影像學(xué)和病理學(xué)檢查確診為NSCLC；③無其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料不全者；②合并其他部位原發(fā)腫瘤或肺部炎性疾病者。選取同期因咳痰、咯血等不適接受鏡檢篩查的80例肺炎或肺結(jié)核患者作為對(duì)照組。NSCLC組中，男52例，女28例；年齡52～78歲，平均（62.35±5.02）歲；鱗癌25例，腺癌25例，大細(xì)胞癌30例。對(duì)照組中，男50例，女30例；年齡50～79歲，平均（62.39±4.43）歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 纖維支氣管鏡檢 患者術(shù)前禁食7 h，術(shù)前30 min靜脈滴注阿托品0.02～0.03 mg/kg以減少呼吸道分泌物，靜脈注射咪達(dá)唑侖0.3～0.4 mg/kg進(jìn)行鎮(zhèn)靜，并給予供氧。患者取仰臥位，根據(jù)患者具體情況給予適當(dāng)全身鎮(zhèn)靜。使用異丙酚靜脈注射進(jìn)行復(fù)合麻醉，將支氣管鏡從患者鼻腔插入，采用CT對(duì)腫瘤進(jìn)行探查，并取出部分組織放入含RNAlater試劑的凍存管中，于-80℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 miRNA-21表達(dá)水平的檢測(cè) 采用RNA提取試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Promega公司）提取總RNA，使用分光光度儀對(duì)RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。采用TaqMan miRNA reverse transcription kit合成全長(zhǎng)互補(bǔ)脫氧核糖核酸。利用PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，以RNU6B作為內(nèi)參反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：15 ℃ 30 min，40 ℃ 30 min，85 ℃ 4 min，4℃儲(chǔ)存。應(yīng)用2-△△CT法計(jì)算miRNA-21表達(dá)水平。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

觀察兩組患者的鏡檢物miRNA-21表達(dá)水平，比較兩組患者的細(xì)胞因子水平，包括γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）；比較兩組患者的腫瘤標(biāo)志物水平，包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神經(jīng)元特異烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）和角蛋白 CYFRA21-1。分析miRNA-21水平與細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢物miRNA-21表達(dá)水平的比較

NSCLC組患者的鏡檢物miRNA-21表達(dá)水平為（8.29±1.15），明顯高于對(duì)照組的（1.35±0.41），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=50.842，P﹤0.001）。

2.2 細(xì)胞因子水平的比較

NSCLC 組患者的 IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6 和TNF-α水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.001）。（表1）

表1 兩組患者細(xì)胞因子水平的比較（ng/L，±s）

表1 兩組患者細(xì)胞因子水平的比較（ng/L，±s）

2.3 腫瘤標(biāo)志物水平的比較

NSCLC組患者的CEA、NSE和CYFRA21-1水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.001）。（表2）

2.4 NSCLC患者鏡檢物miRNA-21表達(dá)水平與細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物水平的相關(guān)性

NSCLC患者鏡檢物miRNA-21表達(dá)水平與細(xì)胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和腫瘤標(biāo)志物CEA、NSE、CYFRA21-1水平均呈正相關(guān)（P﹤0.05）。（表3）

3 討論

近年來肺癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)，目前已成為全球病死率最高的惡性腫瘤[7-8]。NSCLC是肺癌的一種，占肺癌的80%～85%，包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌，與小細(xì)胞癌相比，其癌細(xì)胞生長(zhǎng)分裂較為緩慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚[9]。目前認(rèn)為，吸煙是引發(fā)肺癌最重要的高危因素，同時(shí)輻射、肺部感染、遺傳等因素也是引發(fā)肺癌的原因[10]。肺癌患者在患病早期無特殊癥狀，常表現(xiàn)為胸部脹痛、痰血、低熱和咳嗽等，晚期癥狀則表現(xiàn)為呼吸困難、體重驟減、咳嗽嚴(yán)重、咯血等。盡管近年來手術(shù)、放療、化療等技術(shù)不斷發(fā)展，但多數(shù)肺癌患者在就診時(shí)已處于晚期，腫瘤多發(fā)生了轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者失去了最佳治療時(shí)機(jī)，5年生存率大大降低[11]。

表2 兩組患者腫瘤標(biāo)志物水平的比較（μg/ml，±s）

表2 兩組患者腫瘤標(biāo)志物水平的比較（μg/ml，±s）

組別CEA NSE CYFRA21-1

表3 NSCLC患者鏡檢物miRNA-21表達(dá)水平與細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物水平的相關(guān)性

目前臨床上對(duì)miRNA已有較多的研究，人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了500多種miRNA[12-13]。miRNA是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸，由高等真核生物基因組編碼，通過對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)從而參與一系列生命過程[14-15]。miRNA的主要功能之一是作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和代謝起到了至關(guān)重要的作用，但其作用部位和確切的生物學(xué)功能尚未確定[16-17]。研究顯示，miRNA-21位于染色體的脆性區(qū)17q23.2，其可能作為一種潛在的癌基因或抑癌基因?qū)δ[瘤的發(fā)生和發(fā)展過程產(chǎn)生影響[18]。miRNA-21可能與癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，如在甲狀腺乳頭狀癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、膽管癌中表達(dá)水平明顯上升，發(fā)揮著癌基因的作用[19]。另有研究通過miRNA芯片與生物信息學(xué)技術(shù)人工合成miRNA-21序列，并轉(zhuǎn)染至肺癌A549細(xì)胞中，檢測(cè)細(xì)胞中PTEN基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-21可能主要在翻譯水平上調(diào)控PTEN基因的表達(dá)[20]。

本研究探討了miRNA-21在NSCLC患者中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，NSCLC組患者的鏡檢物miRNA-21表達(dá)水平為（8.29±1.15），明顯高于對(duì)照組的（1.35±0.41），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=50.842，P﹤0.001），表明miRNA-21在NSCLC組織中的表達(dá)水平較高，其可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，進(jìn)一步證實(shí)了miRNA-21的癌基因作用。炎性細(xì)胞因子在人體內(nèi)通常保持平衡狀態(tài)，但一旦引起炎癥，平衡就會(huì)被破壞，導(dǎo)致肺部發(fā)生病理生理性改變。本研究對(duì)兩組患者的細(xì)胞因子水平進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLC組患者的IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.001），表明腫瘤細(xì)胞可通過分泌炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)炎性反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、侵襲和免疫抑制。通過對(duì)兩組患者的腫瘤標(biāo)志物水平進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLC組患者的CEA、NSE和CYFRA21-1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.001）。本研究還發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者鏡檢物miRNA-21表達(dá)水平與細(xì)胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和腫瘤標(biāo)志物CEA、NSE、CYFRA21-1水平均呈正相關(guān)（P﹤0.05），證實(shí)了miRNA-21可以作為肺癌的特異性腫瘤標(biāo)志物，對(duì)肺癌的診斷和預(yù)后具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，miRNA-21在NSCLC組織中的表達(dá)水平明顯升高，且與細(xì)胞因子和腫瘤標(biāo)志物水平密切相關(guān)，其對(duì)肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程起到了重要作用，可應(yīng)用于NSCLC患者的早期診斷及預(yù)后判斷，值得進(jìn)行深入研究。

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