陳 萌，李卓昱，鮑玉杰，袁增智,2*

(1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)為嗜鹽類(lèi)革蘭氏陰性菌，短桿狀，無(wú)芽孢，帶有鞭毛。VP主要分布在海洋環(huán)境中，是重要的食源性病原[1-2]，已經(jīng)成為世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。VP除了會(huì)感染人的腸道，引起腹瀉和腸胃炎，還能感染海洋動(dòng)物，例如蝦類(lèi)，感染后會(huì)引發(fā)蝦類(lèi)的紅腿病。目前對(duì)于弧菌的治療手段普遍是采用抗生素，病菌的抗藥性也在不斷增強(qiáng)[3]，尋找新的藥物靶標(biāo)對(duì)于開(kāi)發(fā)新型VP感染治療藥物非常關(guān)鍵。

已報(bào)道的VP毒力作用因子有侵襲因子、外膜蛋白、尿素酶、黏附因子、蛋白酶、脂多糖、溶血毒素等[4]。而病原體表面蛋白與宿主受體之間的識(shí)別和黏附過(guò)程是病原體侵染的首要因素，因此對(duì)VP黏附機(jī)制的研究尤為重要。Jiang等[5]通過(guò)黏附和抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VP表面的烯醇酶對(duì)上皮細(xì)胞有黏附作用。Gingras等[6]通過(guò)對(duì)比神奈川陽(yáng)性菌和陰性菌發(fā)現(xiàn)，VP普遍對(duì)于人腸道的上皮細(xì)胞具有黏附作用。Nakasone等[7]通過(guò)VP純化的菌毛或純化的菌毛抗體處理兔的腸道細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)VP不能繼續(xù)黏附腸道，推測(cè)VP的菌毛對(duì)腸道的黏附過(guò)程起到重要作用。Caco-2細(xì)胞株來(lái)源于人結(jié)腸癌細(xì)胞，在結(jié)構(gòu)和功能上與人小腸上皮細(xì)胞相似，因此筆者以Caco-2細(xì)胞作為研究對(duì)象，探究其與副溶血弧菌外膜蛋白間的黏附作用。

VP的外膜蛋白位于菌體表面，特殊的位置決定了外膜蛋白在侵染宿主的過(guò)程中可能起到黏附的作用。筆者采用基于生物素化的親和層析技術(shù)對(duì)VP黏附Caco-2細(xì)胞相關(guān)的外膜蛋白進(jìn)行篩選和初步鑒定。

1 材料與方法

1.1材料副溶血弧菌NY-172株是由天津水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供；Caco-2細(xì)胞，大腸桿菌DH5α菌株、BL21(DE3)菌株，pET-28a質(zhì)粒為天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院水生生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器。PCR儀(BIO-RAD，北京伯樂(lè)技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)、凝膠成像儀(GDS-8000，北京六一儀器廠)、電泳儀(DYY-6C)、核酸蛋白檢測(cè)儀(BIO-RAD)、電泳槽(DYCZ-28A，北京六一儀器廠)。

1.2.2試劑。SalⅠ和XhoⅠ限制性酶(TaKaRa公司)；LB固體、液體培養(yǎng)基(生工生物工程股份有限公司)；NHS-PEG4-Biotin、DMEM、胰酶、血清、青霉素鏈霉素雙抗、Chemiluminescent Substrate顯色液(Thermo Fisher Scientific)；His標(biāo)簽單抗、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、辣根過(guò)氧化物酶(horeradish peroxidase,HRP)羊抗鼠標(biāo)記的二抗(天津三箭生物技術(shù)有限公司)；同源重組連接酶(Vazyme公司)。

1.3方法

1.3.1Caco-2細(xì)胞表面蛋白的生物素化標(biāo)記。待Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)至單層，倒去DMEM培養(yǎng)基，PBS沖洗3次后將細(xì)胞刮下置于15 mL無(wú)酶管中離心后收集。沉淀用PBS沖洗3次，重懸至2.5×107個(gè)/mL，添加終濃度為2 mmol/L的NHS-PEG4-Biotin試劑，于4 ℃下孵育30 min，用PBS沖洗3次；添加100 mmol/L的甘氨酸置于4 ℃下反應(yīng)15 min，使用PBS沖洗3次；按照1∶250的比例加入FITC置于37 ℃下反應(yīng)30 min，用PBS沖洗3次；使用熒光顯微鏡觀察，并掃描記錄。將剩余細(xì)胞加入裂解液進(jìn)行裂解，4 ℃下反應(yīng)30 min，4 ℃、1 200 r/min離心取上清，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2副溶血弧菌外膜蛋白的提取。參考王忠等[8]和周麗等[9]的方法提取VP的外膜蛋白。取150 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，4 ℃、6 000 r/min離心20 min。用含有EDTA的Tris-HCl溶液重懸菌體，洗滌沉淀3次，棄上清；加入10 mL含有20 mmol/L PMSF的PBS重懸菌體，并置于45 ℃水浴中40 min，超聲波破碎5 min(振幅39%，破碎5 s，間隔5 s)，超速離心機(jī)140 000 r/min離心30 min，取上清收集外膜蛋白。

1.3.3與Caco-2細(xì)胞表面蛋白結(jié)合的VP外膜蛋白的篩選。將自旋柱做好標(biāo)記，設(shè)置對(duì)照組，用PBS沖洗柱子3次；加入200 μL中性卵白素樹(shù)脂，4 ℃ 500 r/min離心1 min；用PBS平衡柱子2次，4 ℃ 500 r/min離心1 min；將生物素化標(biāo)記的Caco-2細(xì)胞作為試驗(yàn)組，以PBS緩沖液作為對(duì)照組，均加入到自旋柱中，上下顛倒混勻15 min，4 ℃ 500 r/min離心1 min；2組自旋柱分別加入封閉液，于室溫封閉15 min，4 ℃ 500 r/min離心1 min；加入副溶血弧菌的外膜蛋白與之互作，上下顛倒60 min，4 ℃ 500 r/min離心1 min，用洗滌緩沖液清洗5次；添加剛好沒(méi)過(guò)樹(shù)脂的洗脫溶液，先室溫反應(yīng)3～5 min，后4 ℃下500 r/min離心1 min，收集流穿液，送上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.4基因克隆、原核表達(dá)及蛋白純化。通過(guò)質(zhì)譜鑒定得到3個(gè)副溶血弧菌候選外膜蛋白，在NCBI上分別搜索到ATP synthase subunit alpha、ATP synthase subunit beta、outer membrane protein U蛋白的基因編碼序列，通過(guò)SignalP和THMHH在線軟件預(yù)測(cè)后，除去信號(hào)肽或跨膜區(qū)，使用primer primer 5.0設(shè)計(jì)同源重組上下游引物(表1)。同時(shí)試驗(yàn)過(guò)程中使用已報(bào)道過(guò)的黏附因子VpadF作為陽(yáng)性對(duì)照。

提取VP基因組DNA作為模板，PCR擴(kuò)增出序列全長(zhǎng)，對(duì)其進(jìn)行純化膠回收，與pET-28a質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ和XhoⅠ雙酶切的線性化產(chǎn)物進(jìn)行同源重組連接，得到pET-28a-ATPα、pET-28a-ATPβ、pET-28a-OmpU重組質(zhì)粒，送樣測(cè)序。

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)大腸桿菌中，參照杜欣軍等[10]的方法進(jìn)行相應(yīng)蛋白的表達(dá)和純化，簡(jiǎn)述如下：先實(shí)施小量誘導(dǎo)表達(dá)，待確定最佳的誘導(dǎo)條件后進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni柱進(jìn)行親和層析純化，對(duì)于表達(dá)在包涵體中的蛋白用尿素進(jìn)行梯度復(fù)性，使其恢復(fù)活性并透析于PBS緩沖液中保存。

表1 PCR引物序列

1.3.5Western blot檢測(cè)重組蛋白。用5 μg的重組蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，濃縮膠80 V，分離膠120 V電泳分析，PVDF膜先用甲醇浸泡5～10 min，再用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡20～30 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，置于冰上300 mA、2 h；用去離子水洗滌PVDF膜除去SDS，放到封閉液中封閉過(guò)夜，用TBST洗3次，使用His標(biāo)簽單克隆抗體常溫孵育2 h，TBST洗3次；用HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗常溫孵育2 h，TBST洗3次，使用Thermo Chemiluminescent Substrate顯色液，使PVDF膜浸泡其中顯色，BIO-RAD凝膠成像儀掃描并保存。

1.3.6間接免疫熒光驗(yàn)證黏附作用。待Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)至12孔板中長(zhǎng)成單層時(shí)，每個(gè)孔中加入相應(yīng)200 μg重組蛋白，37 ℃ 孵育30 min；PBS沖洗3次，用PBS將多聚甲醛稀釋到濃度為4%(V/V)的反應(yīng)液，添加到12孔板中，常溫反應(yīng)15 min，PBS沖洗3次；使用His單克隆抗體，常溫反應(yīng)30 min，PBS沖洗3次；使用HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，常溫反應(yīng)30 min，PBS沖洗3次；熒光顯微鏡觀察，掃描并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1Caco-2細(xì)胞表面蛋白的生物素化標(biāo)記為了提取Caco-2細(xì)胞表面的蛋白作為垂釣誘餌，使用NHS-PEG4-Biotin 試劑對(duì)Caco-2細(xì)胞表面的蛋白進(jìn)行生物素化。由于該試劑高度親水，因此正常情況下無(wú)法穿透細(xì)胞膜，只有細(xì)胞表面的蛋白才會(huì)被生物素化。進(jìn)一步利用Avidin與生物素的特異性結(jié)合作用來(lái)證明生物素化是否成功。將FITC-Avidin分別與生物素化的Caco-2細(xì)胞和未生物素化的Caco-2細(xì)胞孵育，顯微鏡觀察結(jié)果如圖1所示。結(jié)果能看到生物素化的細(xì)胞表面有明顯的熒光，而對(duì)照組無(wú)熒光，證明Caco-2細(xì)胞表面蛋白成功生物素化，可用于下一步的篩選。

2.2副溶血弧菌外膜蛋白提取將PMSF法提取的外膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)分析，結(jié)果如圖2所示。可以看到外膜蛋白的大小集中在20～90 kD，條帶清晰且均勻，說(shuō)明PMSF方法適用于副溶血弧菌外膜蛋白的提取，外膜蛋白可用于下一步試驗(yàn)。

2.3與Caco-2細(xì)胞表面蛋白結(jié)合的副溶血弧菌外膜蛋白的篩選利用卵白素樹(shù)脂與生物素的親和作用，將Caco-2細(xì)胞進(jìn)行生物素化并固定于卵白素樹(shù)脂，與提取到的VP外膜蛋白進(jìn)行孵育，親和垂釣副溶血弧菌的外膜蛋白。用洗脫緩沖液洗脫樹(shù)脂，分別取洗脫物進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定，結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)與對(duì)照組比較，篩選出ATPα、ATPβ、OmpU共3個(gè)蛋白。經(jīng)在線軟件SignalP 4.1 server預(yù)測(cè)分析ATPα、ATPβ均無(wú)信號(hào)肽,OmpU序列1～21區(qū)域的氨基酸存在信號(hào)肽。在線軟件TMHMM server v 2.0預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示ATPα、ATPβ、OmpU均無(wú)跨膜區(qū)，為胞外蛋白。

注：a.生物素化后的Caco-2細(xì)胞;b.未生物素化的Caco-2細(xì)胞Note: a.Caco-2 cell of pre-biotinylation;b.Caco-2 cell of post-biotinylation圖1 FITC-Avidin標(biāo)記生物素化的Caco-2細(xì)胞Fig.1 Detection of biotinylated Caco-2 cells by FITC-Avidin

注：M.Marker;1.PMSF法提取的外膜蛋白Note:M.Marker;1.the outer membrane proteins with PMSF methods圖2 SDS-PAGE分析PMSF法提取外膜蛋白Fig.2 SDS-PAGE profiles of the outer membrane proteins with PMSF methods

表2候選外膜蛋白質(zhì)譜鑒定及其生物信息學(xué)分析

Table2Massspectrumidentificationandbioinformaticsanalysisofcandidateoutermembraneproteins

蛋白名稱Nameofprotein質(zhì)譜鑒定肽段數(shù)Numberofpeptidefragmentidentifiedbymassspectrum相對(duì)分子質(zhì)量Relativemolecularmass預(yù)測(cè)是否胞外蛋白PredictionofextracellucarproteinATPα2956．0×103是ATPβ2650．0×103是OmpU3336．0×103是

2.4重組蛋白進(jìn)行基因克隆、原核表達(dá)、蛋白純化及Westernblot檢測(cè)將送測(cè)正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，對(duì)其實(shí)施大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，利用親和層析技術(shù)純化蛋白，結(jié)果如圖3a所示。蛋白分子量符合預(yù)期，條帶清晰且單一。進(jìn)一步運(yùn)用Western blot試驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白與多聚組氨酸標(biāo)簽抗體的識(shí)別作用，結(jié)果如圖3b所示。結(jié)果顯示3種重組蛋白均可以被帶有多聚組氨酸標(biāo)簽抗體識(shí)別，可以被用來(lái)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

注：M.Marker;1.ATPα;2.ATPβ;3.OmpU圖3 各重組蛋白純化結(jié)果(a)及檢測(cè)(b)Fig.3 Purification of recombinant protein and Western blot detection

2.5間接免疫熒光驗(yàn)證黏附作用該研究運(yùn)用間接免疫熒光法來(lái)驗(yàn)證純化的重組蛋白ATPα、ATPβ、OmpU與Caco-2細(xì)胞之間是否存在黏附作用，結(jié)果如圖4所示。通過(guò)熒光顯微鏡觀察看到重組蛋白與陽(yáng)性對(duì)照組VpadF對(duì)比都有較強(qiáng)的熒光，而空白組(PBS)和陰性對(duì)照組(BSA)沒(méi)有任何熒光，表明重組蛋白ATPα、ATPβ、OmpU與Caco-2細(xì)胞存在黏附作用。

注：a.PBS;b.BSA;c.VpadF;d.ATPα;e.ATPβ;f.OmpU圖4 間接免疫熒光驗(yàn)證各重組蛋白與Caco-2細(xì)胞間的相互作用Fig.4 Confirmation of the interaction between recombinant proteins and Caco-2 cells by indirect immune-fluorescence assays

3 討論

病原體表面蛋白與宿主靶細(xì)胞受體的黏附作用是病原體侵染的重要環(huán)節(jié)。該研究首次將Caco-2細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行生物素化，利用生物素與卵白素樹(shù)脂的天然親和性，制成有特異性的固相載體，使用層析方法篩選出來(lái)能與Caco-2細(xì)胞表面相互作用的VP外膜蛋白，垂釣得到3個(gè)候選蛋白。ATP合成酶是生物能量代謝的重要酶，不同來(lái)源的ATP合成酶都具有相同的組成單位和亞基，是結(jié)合部分F1和處于膜內(nèi)部親脂的F0，F(xiàn)1包括α、β、γ、ε、σ這5個(gè)亞基[11]。邢林林等[12]通過(guò)表達(dá)培養(yǎng)沉默ATP合成酶的菌株發(fā)現(xiàn)其幾乎不生長(zhǎng)于TSB培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)過(guò)程中加入外源的ATP同樣不能生長(zhǎng)，推測(cè)外源的ATP不能代替細(xì)菌的原有ATP合成路徑，從而證明ATP合成酶與細(xì)菌的生長(zhǎng)密切相關(guān)。而細(xì)菌中ATP合成酶是否參與了黏附宿主的過(guò)程目前尚無(wú)明確報(bào)道。弧菌外膜蛋白中的OmpU是重要的抗原，其序列在弧菌中有較高的同源性。試驗(yàn)證實(shí)OmpU對(duì)哈維氏弧菌[13]、副溶血弧菌[14]、鰻弧菌[15]和 溶藻弧菌[16]均表現(xiàn)出很好的免疫保護(hù)作用。除此之外，Aeckersberg等[17]還發(fā)現(xiàn)費(fèi)氏弧菌中OmpU能幫助其定殖在宿主的新生發(fā)光器官中，從而推測(cè)OmpU可能是具有黏附作用的外膜蛋白。該研究通過(guò)原核表達(dá)和蛋白純化技術(shù)成功得到3個(gè)重組蛋白，并進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證其功能。將VP黏附因子VpadF作為陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)ATPα、ATPβ、OmpU均能與Caco-2細(xì)胞黏附，其中ATPβ的黏附作用最強(qiáng)。因此推測(cè)3個(gè)候選蛋白均是潛在的黏附因子。

綜上所述，該研究篩選出VP外膜蛋白中的3個(gè)潛在黏附因子ATPα、ATPβ、OmpU。該研究成果將有助于探究VP侵染宿主的致病過(guò)程，為下一步病原菌預(yù)防和防治新型藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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