景 嫻， 江 海,2， 陳 琛,2,3

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000；2.陜西省陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心， 陜西 漢中 723000；3.陜西理工大學 中德天然產(chǎn)物研究所， 陜西 漢中 723000)

在治療疾病過程中，為了促進治療效果，通常會采用聯(lián)合用藥技術，聯(lián)合用藥通常會對疾病的治療和臨床反應產(chǎn)生不同程度的改變，這種改變主要通過肝臟中的CYP450酶進行代謝。CYP450酶是重要的Ⅰ相代謝酶，參與內(nèi)源性物質(zhì)和包括藥物、環(huán)境化合物在內(nèi)的外源性物質(zhì)的氧化代謝和還原代謝，主要負責近90%的藥物在人體的肝臟和腸道代謝[1-2]，因此CYP450酶的活性變化能夠反映出聯(lián)合用藥時藥物間的代謝關系及藥物的相互作用[3]。目前歐美各國已將CYP450酶活性的測定用于新藥研發(fā)及藥物代謝研究，并將其列為新藥申報時必須進行的一項試驗，而在試驗過程中通常采用探針藥物法來評價藥物在體內(nèi)對CYP450酶活性變化的影響[4]。探針藥物法“Cocktail”即雞尾酒法，是一種同時給予兩種或多種低劑量的探針藥物，測定生物樣本中每個探針藥物的代謝率，從而一次反映多個CYP450同工酶活性變化的一種方法[5-6]。

非那西丁、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、睪酮、右美沙芬、氯唑沙宗作為CYP450酶系中CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP2D6、CYP2E1使用最廣泛的專屬性底物[7]，且這6種藥物是國際上普遍認可的可作為探針藥物的藥品。對上述6種藥物在體內(nèi)的血藥濃度精確、穩(wěn)定檢測，可以準確了解藥物的代謝狀況，準確判定CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP2D6、CYP2E1酶的活性狀況，科學指導合理用藥?，F(xiàn)常見的藥物檢測方法HPLC-UV法[8]檢測時間慢，樣品處理復雜，檢測限高；LC-MS法[9]檢測限有所降低，但不能同時檢測多種探針底物，試驗結(jié)果不穩(wěn)定。本文在液質(zhì)聯(lián)用分析的基礎上建立了一種準確、快速、穩(wěn)定、靈敏度高的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS)法，并將其應用到藥動學的研究中，為臨床藥動學檢測技術提供一種快速可行的檢測方法。

1 材 料

1.1 儀 器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜串聯(lián)ACQUITY TQD三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；Masslynx V4.1數(shù)據(jù)采集分析軟件；AUW220D十萬分之一電子天平、AUY220萬分之一電子天平(日本島津公司)；Thermo 21微量高速冷凍離心機(美國Thermo公司)；Milli-Q制水機(美國Millcoper公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)。

1.2 藥品與試劑

奧美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗、非那西汀、睪酮(上海源葉生物科技公司，純度≥98%)；甲苯磺丁脲(上海畢得醫(yī)藥科技公司，純度≥97%)；純水(實驗室制水機自制)；乙腈、甲酸均為色譜純(天津科密歐試劑)；其余試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.5 mm,1.7 μm)，柱溫30 ℃，流速0.25 mL/min，進樣量5 μL，檢測波長為270 nm。流動相為：有機相A為乙腈，水相B為0.1%甲酸，采用梯度洗脫方式，乙腈洗脫梯度為0～2 min(10%→20%)，2～5 min(20%→31%)，5～6 min(31%→60%)，6～7 min(60%→10%)，7～7.5 min(10%)。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI),非那西汀、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、睪酮、右美沙芬均為正離子模式檢測(electrospray ionization，ESI+)，氯唑沙宗為負離子模式檢測(ESI-)。錐孔電壓25 kV，離子源溫度130 ℃，脫溶劑氣溫度250 ℃，脫溶劑氣流量500 L/h，采用單離子監(jiān)測(single ion monitoring，SIM)，非那西汀m/z 180,甲苯磺丁脲m/z 271,奧美拉唑m/z 346,睪酮m/z 289，右美沙芬m/z 272，氯唑沙宗m/z 168。

2.3 血漿樣品的制備

吸取大鼠血漿200 μL，加入乙腈800 μL，渦旋振蕩1 min，離心(8000g，4 ℃)10 min，取上層清液400 μL轉(zhuǎn)移至新離心管，4 ℃靜置24 h，再次離心(8000g，4 ℃)5 min，取上清300 μL，過0.22 μm濾膜后備用。

2.4 對照品溶液的制備及標準曲線的確定

取空白大鼠血漿1000 mL，按2.3方法處理后，分別加入0.3 mg的不同標準品,得到6種標準品母液，按比例稀釋后，使其濃度分別為5，50，100，250，500，750，1500 ng/mL。按2.1方法進行進樣檢測，以標準溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標，各組分峰面積值為縱坐標，繪制各標準物質(zhì)的標準工作曲線，得到6種藥物的線性方程見表1。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性

本試驗條件下，非那西丁、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、睪酮、右美沙芬、氯唑沙宗這6種物質(zhì)均有較大的色譜峰，且血漿中雜質(zhì)峰不影響樣品的測定，6種物質(zhì)均有較好的分離度，保留時間分別為3.84,6.50,3.16,6.63,4.46,4.97 min。如圖1所示。

表1 6種底物的線性方程

圖1 6種底物的色譜圖

2.5.2 精密度與準確度

取空白血漿適量，按2.3方法處理，加入不同量的標準品，配制低、中、高各5份樣品，使各藥濃度分別為5，50，100 ng/mL。按照2.1的方法操作，連續(xù)3天進行測定，根據(jù)當日標準曲線計算各待測物的實測質(zhì)量濃度，考察各質(zhì)量濃度下的精密度與準確度，結(jié)果見表2。

2.5.3 穩(wěn)定性

取空白血漿適量，按2.3處理后，配制6種藥物分別為低、中、高3個濃度各5份，分別置于室溫6 h及-20 ℃下反復凍融3次。根據(jù)2.1進行測定，考察6種樣品的穩(wěn)定性。計算各理論值與實測值，RSD值均小于10%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.5.4 基質(zhì)效應

取空白血漿適量，加入相應質(zhì)量濃度的6種藥物標準工作液進樣測定，得相應色譜峰峰面積(C)；另取同體積相應質(zhì)量分數(shù)的標準工作液，使最終質(zhì)量分數(shù)與前者相對應，進樣測定，得相應色譜峰峰面積(B)；基質(zhì)效應(%)=C/B×100%。結(jié)果如表3所示，基質(zhì)效應為88%～106%，RSD<7%，表明基質(zhì)效應基本不影響各個藥物的血藥濃度的測定[10]。

2.5.5 提取回收率

分別處理低、中、高樣品各5份，按2.3方法處理后進樣測定，得相應色譜峰峰面積(A1)；取空白血漿適量，按2.3方法處理后，加入相應質(zhì)量濃度的不同藥物標準工作液，使最終質(zhì)量濃度與前者相對應，進樣測定，得相應色譜峰峰面積(A2)；提取回收率(%)=A1/A2×100%，結(jié)果見表3。

表2 大鼠血漿中6種底物的精密度與準確度

表3 大鼠血漿中6種底物的提取回收率與基質(zhì)效應測定

在建立試驗方法和質(zhì)譜條件優(yōu)化的過程中，將每一個待測物進行掃描時發(fā)現(xiàn)，奧美拉唑、甲糖寧、右美沙芬、睪酮、非那西丁正離子模式反應強，而氯唑沙宗負離子模式反應強，故最后采用兩種不同模式。但在質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化過程中，由于6種物質(zhì)極性具有不同的差異性及試驗條件所限，故最終選擇SIM模式進行試驗。而后期試驗中，將根據(jù)前期試驗進行優(yōu)化，以便能采用MRM(多反應檢測)模式，這樣檢測得到的濃度更精密，專一性更高，試驗結(jié)果更準確。

3 血藥濃度測定及藥動學參數(shù)

3.1 動物試驗

雄性SD大鼠12只，隨機分為給藥組與空白試驗組，大鼠體重約為(250±6.58) g，將稱取好的6種藥物溶于羧甲基纖維素鈉，給予大鼠灌胃給藥，給藥劑量為甲苯磺丁脲(5 mg/kg),氯唑沙宗(20 mg/kg),睪酮(10 mg/kg),右美沙芬(20 mg/kg),奧美拉唑(20 mg/kg)。于給藥后0，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，12，24 h由頸靜脈叢取血0.3 mL于肝素化試管中，靜置2～4 h后，4 ℃離心，取上層血漿于-20 ℃冷凍保存，備用。

3.2 藥物代謝動力學結(jié)果

按2.3方法處理已采血漿后測定各時間點血藥濃度，繪制探針藥物藥-時曲線，如圖2所示。

將血藥濃度測定結(jié)果用DAS2.1.1軟件進行自動擬合，求得6種探針底物的主要藥物代謝動力學(以下簡稱藥動學)參數(shù)，見表4。

表4與圖2結(jié)果為本文所建立的UPLC-MS法測定奧美拉唑、甲糖寧、右美沙芬、睪酮、非那西丁及氯唑沙宗濃度方法所應用的結(jié)果。將上述結(jié)果與所查文獻[11-12]進行對比，本研究所得結(jié)果與文獻報道基本一致。即這6種藥物在同時給予大鼠時，并沒有產(chǎn)生藥物間的相互影響，它們達到血藥濃度最高時的時間也互不影響。主要由于這6種藥物在作為探針底物時，其給予大鼠的藥量少，且這6種藥物針對不同的CYP450同工酶進行代謝，故并沒有產(chǎn)生藥物間相互作用。

表4 給予大鼠6種底物后的主要藥動學參數(shù)

4 結(jié) 論

通過方法學驗證，UPLC-MS同時檢測大鼠血漿中常用CYP450探針藥物奧美拉唑、甲糖寧、右美沙芬、睪酮、非那西丁和氯唑沙宗濃度，該方法具有準確性高、專屬性強、分析速度快、檢出限低等優(yōu)點，能夠準確地對藥物進行代謝分析，并利用CYP450酶活性的變化狀況來對藥物的藥代動力學進行系統(tǒng)研究。

本次試驗構建的檢測方法采用測定探針藥物代謝的變化情況來確定肝臟中代謝酶的活性變化，并以此確定藥物的代謝狀況。這種技術也可用于其他代謝酶含量變化分析，能為其他藥物的藥代動力學研究提供參考。

[參考文獻]

[1] 王亮,郭姣,石忠峰,等.“Cocktail”探針藥物法的研究思路與應用[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2010,12(11):30-34.

[2] 侯叢頌,楊志宏,孫曉波.“cocktail”探針藥物法及其在研究中藥對細胞色素P450影響中的應用進展[J].中國藥理學與毒理學雜志，2013,27(3):445-450.

[3] 郭宇松,李文雅,何朝興,等.鹽酸雙苯氟嗪對大鼠CYP450酶活性的影響[J].中國藥學雜志，2016，51(16):1407-1410.

[4] HARUKA Nishimuta,TETSUYA Nakagawa,NARUAKI Nomura,et al.Species differences in hepatic and intestinal metabolic activities for 43 human cytochrome P450 substrates between humans and ratsor dogs[J].Xenobiotica,2013,43(11):948-955.

[5] 武潔,鐘榮玲,王大為,等.HPLC-MS-MS法測定大鼠血漿中6種CYP450探針藥物及甘草對CYP450酶活性的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(23):110-116.

[6] 高志偉,施孝金,余琛,等.混合探針底物法同時預測細胞色素P450酶5種亞型的抑制作用[J].藥學學報,2007,42(6):589-594.

[7] GUENGRICH F P.Role of cytochrome P450 enzymes in drug-drug interactions [J].Adv Pharmacol，1997，43:27-35.

[8] 宋佳偉.“雞尾酒法”檢測異甘草酸鎂對大鼠P450酶影響[D].蚌埠:蚌埠醫(yī)學院,2014.

[9] Guidance for Industry.Drug interaction studies-study design,data analysis,and implications for dosing and labeling recommendations[EB/OL].Food and drug administration[2014-08-18].http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM292362.

[10] 《化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則》課題研究組.化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則[S/OL].[2005-03-18].http://www.sda.gov.cn/WS01/CL1616/83420.html.

[11] 許瀟,謝林,梁艷,等.LC-MS法同時測定大鼠血漿中咪達唑侖、右美沙芬及奧美拉唑的濃度[J].中國藥科大學學報,2006,37(3):246-250.

[12] HUANG Y, ZHENG S L,ZHU H Y,et al.Effects of aescin on cytochrome P450 enzymes in rats[J].Journal of Ethnopharmacology,2014,151(1):583-590.