楊彥 (湖北中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校護(hù)理系，湖北 荊州 434020)

胡小輝 (長(zhǎng)江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 荊州 434020)

劉玲華 (湖北中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校護(hù)理系，湖北 荊州 434020)

肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，患者中位生存時(shí)間為2～4年，但是診斷延遲時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)8.6～16.8月[1]。診斷延遲的原因與發(fā)生率極低和臨床表型變異大有關(guān)[2]，而各種各樣的ALS模擬綜合征，如多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、原發(fā)性側(cè)索硬化癥、進(jìn)行性肌萎縮和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型等，使ALS診斷更復(fù)雜化[3]。因此，需要尋找ALS的診斷生物標(biāo)記物，以便提高其診斷準(zhǔn)確性。

對(duì)于ALS患者，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的快速退變可能會(huì)導(dǎo)致pNfH顯著升高[4]。近年來(lái)，有關(guān)ALS患者腦脊液(CSF)磷酸化神經(jīng)絲蛋白重鏈(pNfH)變化的研究逐漸增多，Xu Z等采用Meta分析的方法證明了ALS患者CSF和血液中神經(jīng)絲蛋白輕鏈(NFL)水平較健康者和非ALS疾病者明顯升高[5]，但是尚未有報(bào)道采用Meta分析的方法評(píng)估ALS患者CSF pNfH臨床運(yùn)用價(jià)值。因此，我們采用Meta分析的方法估計(jì)了CSF pNfH 在診斷ALS中的作用。

1 資料與方法

1.1 搜索策略

根據(jù)Cochrane手冊(cè)[6]，系統(tǒng)檢索已發(fā)表在“PubMed”、“Springer”和“Medline”數(shù)據(jù)庫(kù)，以及列在文章的參考文獻(xiàn)，時(shí)間限定為至2017年1月，語(yǔ)言限制為“英語(yǔ)”，關(guān)鍵字為“Neurofilament”, “Neurofilament light chain”, “Neurofilament heavy chain” 和 “Amyotrophic lateral sclerosis”。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷為ALS的患者。②回顧性或前瞻性病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)。③對(duì)CSF pNfH水平進(jìn)行檢測(cè)。除此之外，排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①非人類(lèi)的研究、評(píng)論、評(píng)論、會(huì)議、社論和手稿。②病例報(bào)告和病例系列，無(wú)健康或非ALS疾病組對(duì)照。③研究對(duì)象為兒童、青少年和孕婦。④不能從原始文獻(xiàn)中提取CSF pNfH平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3 數(shù)據(jù)提取與質(zhì)量評(píng)價(jià)

兩名研究人員評(píng)估搜索結(jié)果和選定的文章，提取研究數(shù)據(jù)。對(duì)納入報(bào)道的方法學(xué)質(zhì)量評(píng)估采用紐卡斯?fàn)?渥太華評(píng)分(NOS)標(biāo)準(zhǔn)[7]，包括選擇性(0～4分)，可比性(0～2分)，和暴露(0～3分)類(lèi)，低于6分的報(bào)道標(biāo)為低質(zhì)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Chi-squared (I2) 進(jìn)行異質(zhì)性分析。為計(jì)算平均標(biāo)準(zhǔn)均差(Std.md)和95%可信區(qū)間(CI)，當(dāng)異質(zhì)性檢驗(yàn)P≥0.05時(shí)采用固定效應(yīng)模型，當(dāng)異質(zhì)性檢驗(yàn)P<0.05時(shí)采用隨機(jī)效應(yīng)模型。敏感性分析采用亞組分析。漏斗圖評(píng)估發(fā)表偏倚。繪制HSROC評(píng)價(jià)CSF pNfH 在診斷ALS中的敏感性和特異性。異質(zhì)性、合并Std.md、漏斗圖和HSROC模型采用RevMan5.3版(Copenhagen: The Nordic Cochrane Centre, The Cochrane Collaboration, 2014)。并且，采用Meta回歸分析各研究間的異質(zhì)性來(lái)源。Meta回歸采用Comprehensive Meta-Analysis 2軟件 (Biostat, Englewood, NJ)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果及納入研究的一般特點(diǎn)

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，刪除重復(fù)的報(bào)告后，總共檢索到174篇文獻(xiàn)。根據(jù)排除標(biāo)準(zhǔn)，提取了7例病例對(duì)照研究資料[8～14]。在匯總CSF pNfH在診斷ALS過(guò)程中的敏感性和特異性時(shí)，提取了7篇病例對(duì)照研究[8, 9, 11～13, 15, 16]。

納入本次Meta分析的報(bào)道基本特征列于表1。7篇報(bào)道[8～14]共匯集了26組數(shù)據(jù)，有792例參與者，包括500名ALS患者和280例健康或非ALS疾病對(duì)照者。ALS患者癥狀出現(xiàn)的平均年齡為64.5歲。此外，ALS患者平均病程為9.6月(7～85.3個(gè)月)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)技術(shù)，如夾心ELISA、SMI35 pNfHAb(Sternberger)和pNfH ELISA Kit(biovendor)，檢測(cè)CSF pNfH水平。根據(jù)NOS標(biāo)準(zhǔn)[7]，納入的研究方法學(xué)評(píng)分均大于6分。

此外，CSF pNfH在ALS的診斷過(guò)程中的敏感性和特異性數(shù)據(jù)分別從7項(xiàng)報(bào)道[8, 9, 11～13, 15, 16]中提取數(shù)據(jù)(表2)，并用于繪制HSROC模型。7篇報(bào)道中共包括884例參與者，其中有477例ALS患者和407例健康和非ALS疾病對(duì)照者。

2.2 ALS患者腦脊液 pNfH水平

在比較ALS 患者CSF pNfH水平與健康和非ALS疾病對(duì)照組的差異時(shí)匯總了7篇報(bào)道，含25個(gè)亞組，亞組之間存在明顯的異質(zhì)性(I2= 88%，P<0.00001)。因此，采用隨機(jī)效應(yīng)模型計(jì)算合并Std.MD(圖1)。ALS患者pNfH水平高于健康和非ALS疾病對(duì)照組(Pooled Std.MD=1.78，95%可信區(qū)間：[1.16，2.40]，P<0.00001)。

2.3 ALS患者腦脊液NFL水平

當(dāng)比較ALS患者與健康和非ALS疾病對(duì)照者CSF NFL水平時(shí)，共納入3篇報(bào)道共15亞組，亞組之間存在明顯的異質(zhì)性(I2=81%，P<0.00001)。采用隨機(jī)效應(yīng)模型計(jì)算合并Std.MD。ALS患者CSF NFL水平均高于健康和非ALS疾病對(duì)照組(Pooled Std.MD=1.84，95%可信區(qū)間：[ 1.10，2.58 ]，P<0.00001)。

2.4 敏感性分析

根據(jù)人口變異、檢測(cè)技術(shù)、ALS組和對(duì)照組樣本量等進(jìn)行亞組分析。研究人群來(lái)源于中國(guó)的報(bào)道之間存在低異質(zhì)性(I2=55%，P=0.14)。采用了夾心ELISA或SMI35 pNfH抗體檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道之間存在低異質(zhì)性(I2=38%，P=0.21)。此外，ALS患者樣本量為6至30(I2=0%，P=0.78)，0至5(I2= 35%，P=0.06)，31至60(I2= 53%，P=0.14)的報(bào)道之間存在無(wú)或低異質(zhì)性。并且，包含非ALS疾病對(duì)照者的報(bào)道之間存在低異質(zhì)性(I2= 32%，P=0.12)。最后，采用固定效應(yīng)模型顯示表明ALS患者CSF pNfH水平高于正常健康和非ALS疾病對(duì)照組(Pooled Std.MD=1.83，95%可信區(qū)間：[ 1.64，2.01 ]，P<0.00001)。

圖1 森林圖顯示肌萎縮側(cè)索硬化患者腦脊液磷酸化神經(jīng)絲重鏈較對(duì)照組明顯升高CSF腦脊液

圖2 層次綜合受試者工作特征曲線 (HSROC) 模型評(píng)價(jià)采用pNfH ELISA kit(Biovendor)、Sandwich ELISA 和 SMI35 pNfH Ab (Sternberger)檢測(cè)的磷酸化神經(jīng)絲重鏈在鑒別肌萎縮側(cè)索硬化 和健康者及非肌萎縮側(cè)索硬化疾病中的敏感性和特異性

2.5 發(fā)表偏倚

在25組數(shù)據(jù)中，采用漏斗圖視覺(jué)評(píng)估發(fā)表偏倚。漏斗圖中存在不對(duì)稱(chēng)分布，在本Meta分析中存在較高的發(fā)表偏倚風(fēng)險(xiǎn)。

2.6 Meta回歸分析影響ALS患者和對(duì)照組之間的腦脊液pNfH差異的因素

年齡、ALS患者和對(duì)照組樣本量、ALS病程、ALS患者組和對(duì)照組之間的CSF NFL水平Std.MD被匯集到Meta回歸模型中。 ALS患者和對(duì)照組之間CSF pNfH Hedges’s g與CSF NFL水平變化一致(r=0.784，P=0.003)，和ALS患者(r=0.012，P=0.00033)和對(duì)照組(r=0.029，P=0.003)樣本量明顯相關(guān)。此外，CSF pNfH Hedges’s g與ALS患者平均年齡(r=0.055，P=0.140)、對(duì)照組平均年齡(r=0.030，P=0.355)及ALS患者病程(r=0.019，P=0.157)無(wú)關(guān)。

2.7 HSROC模型評(píng)價(jià)CSF pNfH在診斷ALS中的敏感性和特異性

從7篇報(bào)道[8, 9, 11～13, 15, 16]中提取了CSF pNfH在診斷ALS中的敏感性和特異性數(shù)據(jù)，繪制HSROC(圖2)。視覺(jué)評(píng)估HSROC顯示CSF pNfH在從健康或非ALS疾病對(duì)照組中鑒別出ALS患者存在一定的敏感性和特異性。此外，如HSROC所示，用pNfH ELISA試劑盒(Biovendor)的檢測(cè)方法在從健康或非ALS疾病對(duì)照組中鑒別出ALS的敏感性和特異性高于 Sandwich ELISA 或 SMI35 pNfH Ab (Sternberger)檢測(cè)技術(shù)。

3 討論

本次Meta分析表明ALS患者CSF pNfH水平高于健康及非ALS疾病對(duì)照組。雖然納入的報(bào)道間存在明顯的異質(zhì)性，但是亞組分析和Meta回歸發(fā)現(xiàn)了異質(zhì)性的主要來(lái)源。此外，通過(guò)Meta回歸首次揭示CSF pNfH與軸索損傷的標(biāo)記物NFL顯著相關(guān)。

亞組分析探討了人口變異、檢測(cè)技術(shù)、ALS組樣本量對(duì)ALS患者CSF pNfH相對(duì)于健康及非ALS疾病組水平升高的影響。首先，來(lái)源于歐洲的23組數(shù)據(jù)間存在明顯的異質(zhì)性，而2組來(lái)源于中國(guó)的數(shù)據(jù)間具同質(zhì)性。因此，人口變異是異質(zhì)性來(lái)源之一。其次，采用夾心ELISA或SMI35 pNfHAb檢測(cè)技術(shù)探測(cè)CSF pNfH水平的研究間具同質(zhì)性。此外，采用pNfH ELISA Kit技術(shù)探測(cè)CSF pNfH水平的研究間存在顯著的異質(zhì)性。因此，CSF pNfH檢測(cè)技術(shù)可能是異質(zhì)性來(lái)源之一。最后，ALS組樣本量為0～5，6～30，31～60的研究間分別存在無(wú)或低異質(zhì)性，因此ALS組樣本量的大小是異質(zhì)性的一個(gè)來(lái)源。此外，由于ALS患者CSF pNfH變化與ALS和對(duì)照組樣本量呈明顯正相關(guān)，因此健康及非ALS疾病對(duì)照組的樣本量大小也被認(rèn)為是異質(zhì)性的來(lái)源之一。本研究首次報(bào)道了人口變異、檢測(cè)方法、樣本量是ALS患者CSF pNfH水平與健康或非ALS疾病對(duì)照組間差異的主要異質(zhì)性來(lái)源。

pNfH被認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的生物標(biāo)志物[4]。Meta回歸分析顯示，在ALS患者CSF中，pNfH的變化趨勢(shì)和NFL水平變化一致。軸突中NF蛋白的積累有助于維持神經(jīng)元損傷后軸突細(xì)胞骨架的穩(wěn)定，同時(shí)，NF 碳末端磷酸化在軸突生長(zhǎng)中起重要作用[4]。NFL作為NF一個(gè)亞基，隨著時(shí)間的推移，CSF NFL水平升高與ALS患者疾病泛化和皮質(zhì)脊髓束變性嚴(yán)重程度相關(guān)[17]。因此，pNfH作為NF的活性形式，是在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后評(píng)估ALS患者的大腦和脊髓軸突損傷病理變化的較為有價(jià)值的生物標(biāo)記物[14]。

雖然Oeckl等的研究發(fā)現(xiàn)pNfH與ALS的病程之間存在顯著的負(fù)相關(guān)[12]，但是Meta回歸顯示ALS病程與ALS患者CSF pNfH水平變化無(wú)相關(guān)性。原因可能與Oeckl PP等的多中心臨床研究中ALS病程變異范圍較Meta回歸中匯總的ALS患者病程有關(guān)：Oeckl PP等的研究中ALS病程為4月至247.4月[12]，而納入本次Meta分析的ALS患者平均病程為7月至85.3月(表1)。在Ganesalingam J等的研究中，CSF pNfH與ALS病程呈負(fù)相關(guān)[16]，然而，大多數(shù)ALS患者病程少于50月，只能反映CSF pNfH與ALS早期病程的關(guān)系。此外，在Ganesalingam J等的研究中[16]，CSF pNfH主要在ALS疾病早期增加，在ALS疾病后期升高并不明顯[12, 16]。因此，仍然需要更多樣本的前瞻性研究評(píng)估CSF pNfH與ALS病程的關(guān)系。

HSROC顯示CSF pNfH在鑒別ALS和非ALS疾病時(shí)具有較高的敏感性和特異性(圖2)，并且，采用pNfH ELISA試劑盒(biovendor)區(qū)分ALS和非ALS的敏感性和特異性比采用夾心ELISA或SMI35 pNfHAb檢測(cè)方法更高。因此，在區(qū)分ALS和非ALS疾病時(shí)，建議采用pNfH ELISA試劑盒檢測(cè)pNfH CSF水平。

當(dāng)前Meta分析存在一定的局限性。第一，原始研究多為觀察性或橫斷面研究。選擇性偏倚不可避免。第二，雖然人口變異、檢測(cè)技術(shù)，樣本量是納入文獻(xiàn)的主要異質(zhì)性來(lái)源，但是納入文獻(xiàn)的高度異質(zhì)性削弱了ALS患者CSF pNfH水平高于非ALS疾病患者的說(shuō)服力。第三，在匯總分析CSF pNfH水平在ALS患者和健康及非ALS疾病組中的變化時(shí)，研究文獻(xiàn)間存在明顯的發(fā)表偏倚。發(fā)表偏倚可能來(lái)源于未發(fā)表的陰性結(jié)果。第四，不同的中心或?qū)嶒?yàn)室提供的研究樣本量太少(5例)[10,14]。第五，某些研究中ALS患者和對(duì)照組之間平均年齡存在顯著差異，并且對(duì)照組的疾病譜多樣化，嚴(yán)重影響了ALS和對(duì)照組的可比性(表1)。第六，ALS的診斷主要依賴(lài)于臨床表現(xiàn)和肌電圖結(jié)果，采用腰椎穿刺抽取ALS患者腦脊液臨床少見(jiàn)，因此，在評(píng)估ALS患者病情過(guò)程中，檢測(cè)血液pNfH可能會(huì)比CSF更實(shí)用[11]。

表1 納入文獻(xiàn)的基本特征

注：Con.: 對(duì)照組, Se.: 選擇, Co. : 可比性, Ex.: 暴露, ALS: 肌萎縮側(cè)索硬化患者, MND: 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病, MSA: 多系統(tǒng)萎縮, NR: 未涉及, ALS mimic syndrome ALS 模擬綜合征。

表2 采用腦脊液磷酸化神經(jīng)絲重鏈蛋白水平鑒別肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)

注：. 截止值(Cut-off)單位: ng/mL。

總之，ALS患者CSF中pNfH和NFL水平均高于健康或非ALS疾病對(duì)照組。人口變異，pNfH檢測(cè)技術(shù)，樣本量和ALS患者CSF NFL水平是納入研究間的主要異質(zhì)性來(lái)源。如Meta回歸所示，在ALS患者CSF中，pNfH與NFL相關(guān)的軸索損傷和神經(jīng)退變有關(guān)。HSROC模型顯示在鑒別ALS和健康及非ALS疾病中，CSF pNfH水平變化有一定的臨床鑒別價(jià)值。

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