胡瑞娟，吳兆紅 (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院心胸外科，廣東 廣州 510150)

近年來，肺癌已成為所有癌癥中發(fā)病人數(shù)最多的疾病，其死亡率和和病死率呈逐年上升趨勢，已居城市惡性腫瘤之首，肺癌又可細分為小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，后者占據(jù)肺癌發(fā)病率的80%，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是致使患者死亡的主要原因[1]。循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)為自發(fā)或因診斷和治療操作導(dǎo)致實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進入外周血液循環(huán)的腫瘤細胞[2]。我們采用免疫磁珠富集腫瘤細胞結(jié)合免疫熒光染色和熒光原位雜交的循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)[3]，檢測不同分期的非小細胞肺癌患者的CTCs數(shù)目，外周血循環(huán)腫瘤細胞與非小細胞肺癌患者臨床分期的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年6月至2017年6月，經(jīng)手術(shù)、支氣管鏡、縱隔鏡等方式活檢或者經(jīng)細胞學(xué)檢查確診為非小細胞肺癌的72例患者，其中組織病理分型為：腺癌46例，鱗癌22例，腺鱗癌3例，大細胞癌1例；男性35例,女性37例；年齡41～78歲，中位年齡為61歲。臨床分期根據(jù)術(shù)中、術(shù)后的病理、胸部CT、纖維支氣管鏡檢查的結(jié)果，采用國際抗癌聯(lián)盟新頒布的2017第8版肺癌的TNM分期標準分期；其中ⅠA期的病例8例，ⅠB期的10例，ⅡA期5例，ⅡB期5例，ⅢA期8例，ⅢB期5例，ⅢC期6例，ⅣA期的10例，ⅣB期15例。沒有患其他惡性腫瘤或合并其他惡性腫瘤，即原發(fā)腫瘤為肺癌；也同時排除其他器官有重大疾病史、器官功能不全以及器官移植患者。該組病例CTCs檢測前確定沒有接受過任何抗腫瘤的治療。同期抽取來我院體檢的健康對照者28例外周血清標本。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審議通過，所有患者都予以告知研究意義及方案并獲得同意。

1.2 檢測方法

采用免疫磁珠富集腫瘤細胞結(jié)合免疫熒光染色和熒光原位雜交的循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)[3]。應(yīng)用真空采血管采集肘正中靜脈血。為防止靜脈穿刺過程中上皮細胞污染，前2mL血不采集，采集此后的3.2mL靜脈血于ACD抗凝管中。采集的血液在48h內(nèi)去除血漿，裂解液去除紅細胞，磁珠孵育混勻去除白細胞，分離液分離富集腫瘤細胞。使用CD45抗體進行細胞免疫熒光檢測，用7、8號著絲粒探針進行熒光原位雜交。在熒光顯微鏡下計數(shù)，二倍體信號或者CD45陽性為正常細胞，大于等于三倍體且CD45陰性為異常細胞，≥2個異常細胞判斷為循環(huán)腫瘤細胞陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

經(jīng)免疫磁珠陰性法富集后，利用7、8號染色體著絲粒探針標記細胞，通過雜交信號判斷是否存在超二倍體細胞。72例惡性腫瘤患者中有40例出現(xiàn)7、8號染色體拷貝數(shù)增多，即超二倍體細胞(陽性率為55.56%)。而健康組的陽性率為0%。

循環(huán)腫瘤細胞陽性率為55.56%(40/72)，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的陽性率分別是33.3%、60.0%、57.9%、68.0%，陽性病例：ⅠA期3例(3/8)，ⅠB期3例(3/10)，ⅡA期3例(3/5)，ⅡB期3例(3/5)，ⅢA期5例(5/8)，ⅢB期3例(5/8)，ⅢC期3例(3/6)，ⅣA期6例(6/10)，ⅣB期11例(11/15)。表現(xiàn)為陰性32例(假陰性率44.44%)：ⅠA期5例，ⅠB期7例，ⅡA期2例，ⅡB期2例，ⅢA期3例，ⅢB期2例，ⅢC期3例，ⅣA期4例，ⅣB期4例。循環(huán)腫瘤細胞陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外，Ⅲ期和Ⅳ期CTCs達到5以上的患者人數(shù)明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期，見表1。

表1 循環(huán)腫瘤細胞陽性率與非小細胞肺癌臨床分期的關(guān)系

3 討論

在本研究中，非小細胞肺癌患者的循環(huán)腫瘤細胞的檢測總陽性率為55.56%，而同期非惡性腫瘤患者中循環(huán)腫瘤細胞的檢測率為0%，這說明本研究使用的循環(huán)腫瘤細胞的檢測方法有較好的特異性。本研究使用的方法是使用磁珠富集腫瘤細胞，并結(jié)合了免疫熒光染色和熒光原位雜交兩種技術(shù)，不受上皮標志物表達所限，可提高循環(huán)腫瘤細胞檢測的敏感性和特異性[4]。

臨床分期是評價非小細胞肺癌的基本方法。本研究發(fā)現(xiàn)，在ⅠA、ⅠB、ⅡA、ⅡB、ⅢA、ⅢB、ⅢC、ⅣA、ⅣB期CTCs陽性率分別為37.5%、30.0%、60.0%、60.0%、62.5%、60.0%、50.0%、60.0%、73.3%。說明CTCs陽性率及數(shù)目可以成為臨床分期的一個重要指標和佐證。

由于循環(huán)腫瘤細胞是腫瘤細胞脫落進入血液系統(tǒng)的，故極易隨著血流進入身體其他器官，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[5,6]。有研究在非小細胞肺癌患者中發(fā)現(xiàn)，CTCs可以早期預(yù)測腫瘤的轉(zhuǎn)移[7]，本研究入組病例數(shù)少、特別是早期病例不多，還需要進一步研究證實。此外，還有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌患者外周血中存在的CTCs與患者的療效及預(yù)后有極大相關(guān)性，當CTCs≥5時，預(yù)后更差[8]。

綜上所述，CTCs檢測的陽性率與非小細胞肺癌的臨床不同分期呈正相關(guān)性，可用于NSCLC的病情監(jiān)測、療效評估及預(yù)測預(yù)后。但循環(huán)腫瘤細胞的檢測中仍存在假陰性，對于非小細胞肺癌的臨床意義還有待進一步的驗證。

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