李曉娟,李柱剛,王 珣,韓俊巖,趙 偉,趙 日,陸 杰

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站,黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 黑龍江省作物與家畜分子育種重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150086; 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所,黑龍江哈爾濱 150086; 3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊齊哈爾分院,黑龍江齊齊哈爾 161041)

南瓜屬葫蘆科蔓生草本植物,富含多種營養(yǎng)物質(zhì),具有很好的食療保健功效,其中南瓜對糖尿病的預(yù)防作用最受矚目。譚桂軍[1]研究發(fā)現(xiàn)南瓜具有防治糖尿病的功效是幾種成分共同作用的結(jié)果,熊學(xué)敏等[2]證實南瓜多糖具有降糖作用。南瓜中的淀粉屬均一性多糖,包括直鏈淀粉和支鏈淀粉,有研究表明常吃富含直鏈淀粉的食物能降低機(jī)體對胰島素的需求[3-4],這可能是南瓜具有降糖作用的原因之一。南瓜中直鏈與支鏈淀粉含量的比率,不僅是影響食用口感的關(guān)鍵,同時也是影響其功效的要素之一[5]。

傳統(tǒng)的分光光度法為雙波長比色法的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。單波長法是通過測定直鏈淀粉及總淀粉含量進(jìn)而得出支鏈淀粉含量的方法,準(zhǔn)確度較低[6]。雙波長比色法以同一樣液為對象,以不同波長下吸光度差值為測定值,具有較高準(zhǔn)確性[7]。雙波長比色法常以馬鈴薯為標(biāo)準(zhǔn)品,目前已被廣泛應(yīng)用于高粱、木薯、山藥、錐栗、青稞等農(nóng)作物中直鏈和支鏈淀粉含量的同時測定[8-12]。但標(biāo)準(zhǔn)品和樣品往往存在差異,比如南瓜與馬鈴薯的直鏈與支鏈淀粉紫外掃描光譜就有明顯差異,這樣測定結(jié)果就難免存在一定偏差。

因此,為了避免因?qū)φ掌凡町惍a(chǎn)生的偏差,本文以南瓜為原料,分離純化直鏈與支鏈淀粉,采用雙波長比色法測定了南瓜中直鏈與支鏈淀粉含量,并進(jìn)行方法學(xué)驗證。此方法的建立,可為研究南瓜淀粉理化特性提供基礎(chǔ),為促進(jìn)我國南瓜資源的深度開發(fā)、利用提供保證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜粉 市售;石油醚、正丁醇、異戊醇、鹽酸、氫氧化鈉、酒石酸氫鉀、碘、碘化鉀、無水乙醇等 均為分析純。

UV-1601紫外可見分光光度計 日本島津SHIMADZU;1-15臺式離心機(jī) 德國Sigma;PB-10酸度計 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;GR-240 熱空氣消毒箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 南瓜粉的脫脂處理 采用索氏抽提器對南瓜粉進(jìn)行脫脂處理。用濾紙將烘干后的南瓜粉包好,加入石油醚(沸程30～60 ℃)至索氏抽提瓶內(nèi)2/3處,加熱回流至溶液無色(8～10 h,65 ℃),干燥、粉碎后備用。

1.2.2 南瓜待測樣品的制備 準(zhǔn)確稱取干燥脫脂的南瓜粉樣品10.00 g于燒杯中,加入200 mL蒸餾水,65 ℃攪拌提取1 h,8000 r/min離心20 min分離提取液,將提取液濃縮至1/3,加入濃縮液2.5倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%乙醇攪拌均勻,靜置過夜,分離沉淀物,并以無水乙醇洗去雜質(zhì),干燥后(40 ℃,8 h),即得南瓜待測試樣。

1.2.3 南瓜直鏈與支鏈淀粉的分離與純化 淀粉的粗分離參照Li等[13]的方法,得到粗直鏈和粗支鏈淀粉。將預(yù)先配制好的240 mL正丁醇飽和水溶液加入粗直鏈淀粉中,攪拌加熱至溶液澄清后靜置24 h(4 ℃)?；旌弦河? ℃、4000 r/min條件下離心20 min,得沉淀物。按以上步驟重復(fù)3次后,沉淀物以無水乙醇洗去雜質(zhì)并浸泡24 h,干燥(40 ℃,8 h)后即得純直鏈淀粉。

在粗支鏈淀粉中加入20 mL正丁醇,加熱攪拌至溶液澄清后靜置48 h(4 ℃)。混合液于于4 ℃、4000 r/min條件下離心20 min,棄去沉淀物,將上清液按上述步驟重復(fù)純化3次。將最終獲得的上清液濃縮至原來的1/2,加入2倍體積無水乙醇,降溫至4 ℃,收集沉淀物。將沉淀物溶解于200 mL 0.5 mol/L NaOH溶液后再次加入2倍體積的無水乙醇沉淀,收集沉淀復(fù)溶于200 mL蒸餾水后再次以2倍體積無水乙醇沉淀并洗去雜質(zhì),40 ℃干燥8 h,即得純支鏈淀粉。

1.2.4 南瓜直鏈和支鏈淀粉純度的表征 參照Gilbert等[14]的方法測定分離得到直鏈和支鏈淀粉的純度。分別稱取0.01 g直鏈和0.05 g支鏈淀粉各置于50 mL容量瓶中,分別加入10 mL 1 mol/L NaOH溶液,加熱使樣品溶解,冷卻后,各量取1 mL直鏈與支鏈淀粉溶液,調(diào)節(jié)溶液pH為3.5,并加入0.07 g酒石酸氫鉀和0.5 mL碘試劑,蒸餾水定容50 mL,顯色30 min,以碘溶液做空白,在500～700 nm范圍內(nèi)測定樣品的最大吸收波長,并測定該波長下吸光度Amax,按下式計算樣品的藍(lán)值。

藍(lán)值=4×Amax/c

式(1)

式中,c為樣品質(zhì)量濃度,mg/100 mL。

1.2.5 南瓜直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別稱取0.10 g南瓜待測樣品、直鏈和支鏈淀粉,加入10 mL 1 mol/L NaOH溶液,加熱振蕩至樣品徹底溶解,蒸餾水定容100 mL,即得1.00 g/L南瓜淀粉樣品、直鏈和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確量取1.00 g/L南瓜待測樣品1.5 mL,并分別量取直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL,支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL于50 mL燒杯中,加入一定量蒸餾水,用0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至3.5,加入0.5 mL碘試劑,容量瓶定容50 mL,配制成南瓜樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作液,以蒸餾水作空白,顯色20 min,測定吸光度。

1.2.6 雙波長比色法的方法學(xué)驗證

1.2.6.1 精密度評價方法 按照1.2.5方法測定同一樣品4次,計算樣品含量平均值(x,以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表征方法的精密度。

式(2)

1.2.6.2 準(zhǔn)確性評價方法 精密量取實驗純化得到的直鏈和支鏈淀粉純品,加入已知含量的樣品中,按1.2.5方法測定混合樣品含量,計算回收率以評價方法的準(zhǔn)確性。

回收率(%)=(加入標(biāo)品后含量(ng)-樣品含量(ng))/加入標(biāo)品量(ng)×100

式(3)

式(4)

式(5)

由下式計算檢出限:

DL=k·s1

式(6)

式中,DL為檢出限,mg/mL或%;s1為濃度或含量測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差,mg/mL或%;k等于2或3。

1.2.7 單波長法測定南瓜樣品淀粉含量 南瓜待測樣品中總淀粉含量的測定參照GB/T5009.9-2003中酸水解法[16];直鏈淀粉含量的測定參照標(biāo)準(zhǔn)NY147-88的方法[17];支鏈淀粉含量通過計算總淀粉含量與直鏈淀粉含量的差值得出。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品設(shè)3個平行,測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜直鏈和支鏈淀粉的藍(lán)值

藍(lán)值是表示淀粉與碘結(jié)合能力的重要指標(biāo),利用淀粉-碘復(fù)合物吸收峰存在的差異也可對直鏈和支鏈淀粉的純度進(jìn)行表征。由于構(gòu)成直鏈淀粉的葡萄糖單元較多,約有800～1200個,所以直鏈淀粉的藍(lán)值一般在0.8～1.2之間,直鏈淀粉-碘復(fù)合物的吸收峰在600～680 nm,實驗分離純化的南瓜直鏈淀粉的藍(lán)值和最大吸收波長分別為0.874和645 nm;而支鏈淀粉的葡萄糖單元較少,約14～30個,所以支鏈淀粉的藍(lán)值一般在0.08～0.22之間,支鏈淀粉-碘復(fù)合物的吸收峰在520～590 nm[5],實驗分離純化南瓜支鏈淀粉的藍(lán)值和最大吸收波長分別為0.196和565 nm,表明純化樣品純度較高。

2.2 直鏈和支鏈淀粉測定波長的確定

按1.2.5配制的高濃度直鏈和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)工作液顯色后,在400～800 nm范圍內(nèi)掃描,將吸收曲線疊加繪制在同一坐標(biāo)系里。采用等吸收點作圖法選定直鏈和支鏈淀粉的測定波長分別為645、565 nm,參比波長分別為495、730 nm(圖1)。

圖1 直鏈和支鏈淀粉的測定波長和參比波長的確定Fig.1 The determination wavelength and reference wavelength of amylase and amylopectin

2.3 雙波長比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.3.1 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線 以直鏈淀粉濃度為橫坐標(biāo),以645 nm為測定波長,495 nm為參比波長,二者吸光度差值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2),其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下:

圖2 直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of amylose

y=0.3127x+0.0043

式(7)

該方程決定系數(shù)(R2)為0.9981,說明在直鏈淀粉濃度0.004～0.028 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線 以支鏈淀粉濃度為橫坐標(biāo),以565 nm為測定波長,730 nm為參比波長,二者吸光度差值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3),y=4.4009x+0.0074,R2=0.9973,0.02～0.07 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of amylopectin

2.4 雙波長比色法的方法學(xué)評價

2.4.1 精度分析 如表1所示,按質(zhì)量百分含量計算,南瓜中直鏈淀粉占南瓜待測樣品質(zhì)量的21.64%,支鏈淀粉占南瓜待測樣品質(zhì)量的50.19%,實驗中總淀粉含量為直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的總和71.83%。周愛梅等[18]采用酸水解法測定三個南瓜品種淀粉含量為84.89%～86.48%。這可能是因為酸水解法無法排除天然糖分的影響,導(dǎo)致結(jié)果偏高。實驗中,實驗值的RSD均小于2%,說明該檢測方法重復(fù)性良好,具有較高的精度。

表1 直鏈和支鏈淀粉含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)Table 1 The concentrations and relative standard deviations of amylase and amylopectin(%)

2.4.2 準(zhǔn)確性分析 由表2可知,樣品測定回收率的平均值在98.62%～99.42%之間,在可接受范圍內(nèi),RSD分別為2.43%和2.67%,表明該分析方法準(zhǔn)確度較高。

表2 樣品回收率Table 2 Recovery rates of amylose and amylopectin from samples

2.4.3 檢出限分析 直鏈和支鏈淀粉濃度及標(biāo)準(zhǔn)偏差如表3所示。根據(jù)1.2.6.3中公式(6)分別計算出直鏈淀粉的DL為0.0116 mg/mL,支鏈淀粉的DL為0.0644 mg/mL(k=2)。證明該分析方法可檢測范圍較大,實用性較強。

表3 直鏈和支鏈淀粉濃度及標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 The concentrations and standard deviations of amylose and amylopectin

2.5 雙波長法與單波長法的比較分析

如表4所示,單波長法測得南瓜待測樣品的總淀粉含量為82.36%,明顯高于雙波長比色法71.83%,這可能是由于酸水解法雖然在處理過程中去除了可溶性糖類,但無法排除部分難溶的非淀粉性糖類對檢測結(jié)果的影響。與雙波長法相比,單波長法所得直鏈淀粉含量略高,一方面可能是由于支鏈淀粉干擾所引起的差異,另一方面該檢測方法是針對稻米米質(zhì)測定所采用的標(biāo)準(zhǔn)方法。兩種方法所得支鏈淀粉含量差別較大,這可能是由于單波長法所得支鏈淀粉含量是由總淀粉含量和直鏈淀粉含量的差值計算所得,因此無法排除總淀粉含量和直鏈淀粉含量測定中的誤差,從而導(dǎo)致測定結(jié)果的不同。

表4 不同方法測定南瓜總淀粉、直鏈和支鏈淀粉含量比較(%)Table 4 Comparison of starch,amylose and amylopectin content by different methods(%)

3 結(jié)論

首次實現(xiàn)了南瓜中直鏈和支鏈淀粉的分離與純化。以南瓜中直鏈與支鏈淀粉為對照品,確立了南瓜樣品中淀粉含量測定的雙波長比色法,通過精度、準(zhǔn)確性以及檢出限分析證明該檢測方法具有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。與單波長法相比,該方法更加高效便捷,此外,雙波長法以吸光度差值為測定值,排除了不同參比液之間的誤差,從而也提高了檢測的靈敏度和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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