任歡歡,楊曉宇,梁曉娟,陳澤林,馬 花,張 繼,*

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730070; 2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心,甘肅蘭州 730070)

木薯(ManihotesculentaCrantz),多年生植物,廣泛栽培于熱帶和亞熱帶地區(qū),塊根含淀粉量達(dá)25%～35%,有地下糧倉之稱[1],在我國華南地區(qū)已大面積種植,以廣西、廣東和海南最多[2],在食品、藥品、化妝品及燃料生產(chǎn)方面呈現(xiàn)廣泛的應(yīng)用前景[3-5]。木薯產(chǎn)量高,有很強(qiáng)的適應(yīng)性,可在荒山、荒坡及鹽堿地等貧瘠土壤生長,在我國具有很大的潛在種植面積,這為食品及其他行業(yè)提供大量原料[6-8]。

工業(yè)上把淀粉水解轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x葡萄糖的過程稱為糖化或轉(zhuǎn)化[9],糖化是發(fā)酵行業(yè)的重要步驟之一,糖化液的品質(zhì)決定了后續(xù)發(fā)酵過程中是否有足夠的可發(fā)酵糖類[10]。比較常用的淀粉糖化工藝主要包括3種:酸法、酶法和酸酶結(jié)合法。采用酸法水解會伴隨葡萄糖的復(fù)合和分解反應(yīng)發(fā)生,對產(chǎn)品的純度有一定的影響,其純化過程也很復(fù)雜;使用酶法則可有效提高產(chǎn)量,降低成本,且能獲得較高純度的產(chǎn)品[11]。超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)可促進(jìn)酶與木薯淀粉充分混合[12],克服了單純酶解浸出時間長、浸出溫度高、有效成分受熱過程長、雜質(zhì)浸出多、能源消耗大等缺陷,從而提高了木薯淀粉糖化的經(jīng)濟(jì)效益[13]。

本文通過超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)對木薯淀粉進(jìn)行預(yù)處理,采用耐高溫α-淀粉酶和糖化酶協(xié)同對木薯淀粉進(jìn)行酶解,解決了產(chǎn)物糖化率較低的問題。并進(jìn)一步用SEM、FT-IR、GC-MS等測試手段對木薯淀粉糖化前后的物質(zhì)進(jìn)行了分析,旨在為以木薯淀粉為原料的發(fā)酵工業(yè)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木薯淀粉 廣西紅楓淀粉有限公司;檸檬酸 天津市福晨化學(xué)試劑廠;酒石酸鉀鈉 宜興化學(xué)試劑廠;苯酚 煙臺市雙雙化工有限公司;3,5-二硝基水楊酸(DNS)、磷酸氫二鈉 上海中秦化學(xué)試劑有限公司;無水亞硫酸鈉 上海硫酸廠;耐高溫α-淀粉酶(酶活力2萬U/g)、糖化酶(酶活力10萬U/g) 北京沃比森科技有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 阿拉丁試劑有限公司。

HSY2-SP恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;JD500-3電子天平 沈陽龍騰電子有限公司;C21-SDHCB66T蘇泊爾超薄電磁爐 浙江蘇泊爾股份有限公司;UV1000紫外可見分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器股份有限公司;DHG-9143B5電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;Scientz-4D杯式超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;Nicolet iS10傅立葉變換紅外光譜儀 Thermo Fisher Scientific;HITACHI S-450掃描電子顯微鏡 日本日立公司;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 Thermo Fisher Scientific。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲波協(xié)同復(fù)合酶解木薯淀粉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取30 g木薯淀粉，添加一定的蒸餾水，攪勻，在一定的功率下超聲處理一定時間后添加一定的耐高溫α-淀粉酶，再將其置于90 ℃水浴鍋中保溫40 min進(jìn)行液化，取出后加入一定的糖化酶，調(diào)pH到定值，再將其置于一定溫度的水浴鍋中加熱一定時間，取出后待其冷卻至室溫后用SBA-40D生物傳感分析儀測其葡萄糖含量，計(jì)算其DE值。SEM、FT-IR、GC-MS的表征方法則在1.2.5、1.2.6、1.2.7中有詳細(xì)的描述。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示。

圖1 木薯淀粉糖化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖Fig.1 Experimental design of cassava starch saccharification

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 考慮到實(shí)驗(yàn)的可操控性,木薯淀粉液化條件參考郝曉敏等[14]的實(shí)驗(yàn)條件略作修改(耐高溫α-淀粉酶添加量120 U/mL淀粉乳,液化溫度90 ℃,液化pH6.0,液化時間40 min);以超聲時間15 min、超聲功率800 W、糖化時間100 min、糖化溫度65 ℃、糖化酶添加量5 g/L、pH5.0、料液比9∶20 (g/mL)作為單因?qū)嶒?yàn)的基礎(chǔ)條件,研究超聲時間(0、5、15、20、25、30 min)、超聲功率(0、300、600、900、1200、1500、1800 W)、糖化時間(70、80、90、100、110、120、130 min)、糖化溫度(50、55、60、65、70、75、80 ℃)、糖化酶添加量(2、3、4、5、6、7、8 g/L)、糖化pH(2、3、4、5、6、7、8)、料液比(3∶20、4∶20、5∶20、6∶20、7∶20、8∶20、9∶20、10∶20、11∶20 (g/mL))對DE值的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取影響木薯淀粉糖化的主要因素糖化時間、糖化溫度、糖化酶添加量以及糖化pH為考察變量,選取DE值為評價(jià)指標(biāo),采用Design Expert 8.0.6設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Levels and code of response surface experiment

1.2.4 DE值的測定 還原糖含量的測定方法在樊曉輝[15]、楊貴明[16]的測定方法上略作修改:取待測糖化液0.5 mL,加pH4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.5 mL,DNS試劑3 mL,沸水浴7 min,快速冷卻后加蒸餾水5 mL,在530 nm處測其吸光值,采用蒸餾水作為對照組。以葡萄糖為標(biāo)樣,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.5312X+0.0080(R2=0.9992),式中:Y為OD值,X為葡萄糖濃度。DE值的計(jì)算方法如下:

1.2.5 掃描電子顯微鏡(SEM)對木薯淀粉顆粒超聲前后的觀察 樣品的處理借鑒郝曉敏等[14]的方法:取少量經(jīng)冷凍干燥處理過的樣品置于樣品臺的雙面膠上,涂抹均勻,用吸耳球?qū)悠份p吹成單層,放在表面處理機(jī)中鍍金,取出后用掃描電子顯微鏡在25 kV超高電壓、真空條件和放大3200倍下觀察木薯淀粉超聲處理前后的形貌變化。

1.2.6 FT-IR對木薯淀粉的檢測 溴化鉀壓片法[17],波數(shù)范圍4000～400 cm-1,掃描累加16次,分辨率為4 cm-1。

1.2.7 GC-MS對木薯淀粉糖化液中單糖組成的分析 樣品的水解:精確稱取干燥至恒重的木薯淀粉、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品及制得的木薯淀粉糖化產(chǎn)物各10 mg依次置于三個50 mL反應(yīng)瓶中,再分別加入4 mL三氟乙酸溶液(TFA)(4 mol/L),120 ℃下氮?dú)獗Ｗo(hù)水解8 h,室溫冷卻后,減壓除去TFA。

水解產(chǎn)物的衍生化:將除去TFA的三組樣品各加入10 mg鹽酸羥胺和1 mL吡啶,于90 ℃氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)30 min,反應(yīng)液冷卻至室溫后,分別加入1 mL乙酸酐,90 ℃下氮?dú)獗Ｗo(hù)繼續(xù)反應(yīng)30 min,進(jìn)行乙?；苌锏闹苽?。待反應(yīng)冷卻至室溫后,減壓蒸干,各加1 mL氯仿溶解,取1 μL進(jìn)行GC-MS分析[18]。

GC-MS分析:采用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀,配備DB-5MS UI毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。氣相色譜條件:載氣為高純氦氣;進(jìn)樣口溫度250 ℃;程序升溫,起始溫度160 ℃,保持3 min,以2 ℃/min升至210 ℃,保持1 min;載氣流速1.0 mL/min,不分流速,進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件:接口溫度250 ℃;離子阱溫度:150 ℃;電離方式:EI;電子轟擊能量:70 eV;溶劑延長時間:3 min;全掃描范圍:m/z 50～800;模式:選擇離子掃描(SIM)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計(jì),采用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Origin 9.0繪圖軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯淀粉糖化的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 超聲時間對木薯淀粉糖化的影響 超聲波產(chǎn)生的機(jī)械作用和空化作用可以破壞木薯淀粉顆粒的結(jié)構(gòu),使酶等試劑更容易進(jìn)入淀粉顆粒內(nèi)部進(jìn)行反應(yīng)[19]。由圖2可知,超聲時間從0～30 min,DE值出現(xiàn)先增大后減小的變化規(guī)律,在超聲時間15 min時DE值達(dá)到最大?？赡苁窃?5 min的處理中,超聲作用使木薯淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)受到破壞,淀粉顆粒出現(xiàn)更多的縫隙,使底物與酶等的接觸更加充分,促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行,故DE值升高;15 min后,長時間的超聲作用使得抗酶解淀粉含量上升,淀粉的抗酶解能力提高[20],引起DE值降低。所以,在后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中,固定超聲時間為15 min。

圖2 超聲時間對木薯淀粉糖化的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on saccharification of cassava starch

2.1.2 超聲功率對木薯淀粉糖化的影響 適宜功率的超聲處理能促進(jìn)木薯淀粉糖化反應(yīng)的進(jìn)行,但超聲波功率過高,則會導(dǎo)致淀粉酶結(jié)構(gòu)的快速降解[21],反而不利于糖化的進(jìn)行。圖3顯示出,在0～1800 W內(nèi),隨超聲功率的增大,DE值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,且在超聲功率為900 W時,DE值達(dá)到最大,最有利于糖化的進(jìn)行?？赡苁?在0～900 W,低功率的超聲作用使木薯淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)得到適度破壞,促進(jìn)了糖化的進(jìn)行,因此DE值升高;在900～1800 W,過高的超聲功率破壞了淀粉酶的空間結(jié)構(gòu),抑制了酶的活性,對木薯淀粉的糖化產(chǎn)生了阻礙作用,所以DE值降低。故在后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中,為有利于木薯淀粉的糖化,將超聲功率確定為900 W。

圖3 超聲功率對木薯淀粉糖化的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power on saccharification of scassava starch

2.1.3 糖化時間對木薯淀粉糖化的影響 木薯淀粉的糖化程度與糖化時間有很大的關(guān)系,糖化時間過短,糖化過程不完全;糖化時間過長,則會使糖化周期延長。由圖4可看出,從70～130 min,隨著糖化時間的變化,DE值不斷增大,在100 min達(dá)到最大;隨后DE值又逐漸減小?？赡茉蚴?在70～100 min,還原糖逐漸增多,DE值也逐漸增大;在100～130 min,由于糖化液中一部分葡萄糖重新結(jié)合生成異麥芽糖等復(fù)合糖類[22],造成產(chǎn)物中還原糖含量減少,引起DE值逐漸變小。所以糖化時間的適宜范圍為90～110 min。

圖4 糖化時間對木薯淀粉糖化的影響Fig.4 The effect of treatment time on saccharification of cassava starch

2.1.4 糖化溫度對木薯淀粉糖化的影響 溫度對酶不但有促進(jìn)作用也有抑制作用:溫度過低,酶活性不高;溫度過高,會使酶失活。由圖5所示,從50～80 ℃,DE值隨糖化溫度呈先增大后減小的趨勢,在65 ℃達(dá)到最大值。引起該變化的可能原因是:在65 min之前,隨著溫度的升高,糖化酶的活性逐漸增強(qiáng),使反應(yīng)速率加快,引起DE值升高;到65～80 min時,越來越高的溫度反而使糖化酶的活性受到抑制,還原糖的生成速率也開始變慢,另外異麥芽糖等副產(chǎn)物的生成會造成部分還原糖的浪費(fèi),故DE值逐漸變小。因此,糖化溫度的適宜范圍為60～70 ℃。

圖5 糖化溫度對木薯淀粉糖化的影響Fig.5 The effect of temperature onsaccharification of cassava starch

2.1.5 糖化酶添加量對木薯淀粉糖化的影響 糖化酶能夠?qū)⒛臼淼矸鬯鉃槠咸烟?糖化酶添加量過多,則成本增加,且因生成復(fù)合糖類而降低糖化率;酶添加量過少,則糖化過程不徹底,達(dá)不到最佳糖化效果。由圖6可知:當(dāng)糖化酶添加量從2 g/L升至8 g/L的過程中,DE值先增大,在5 g/L時達(dá)到最大,再增加糖化酶添加量,DE值反而下降?？赡苁窃?～5 g/L,隨糖化酶添加量的增加,還原糖的產(chǎn)量逐漸變多,在5 g/L時反應(yīng)體系對糖化酶的需求量達(dá)到飽和,故DE值達(dá)到最大值;在5～8 g/L,糖化酶添加量趨于剩余,因生成復(fù)合糖類而降低糖化率,故DE值逐漸減小。所以,在后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中將糖化酶添加量的范圍選取為4～6 g/L。

圖6 糖化酶添加量對木薯淀粉糖化的影響Fig.6 The effect of enzymatic dosage on saccharification of cassava starch

2.1.6 糖化pH對木薯淀粉糖化的影響 pH過高或過低對糖化酶的活性都有明顯的影響。由圖7可知,pH從2～8,DE值出現(xiàn)先增大后變小的變化規(guī)律,pH在5時DE值達(dá)到最大?？赡茉蚴?pH從2～5,糖化酶活性逐漸增強(qiáng),還原糖越聚越多,引起DE值變大;pH從5～8,該變化逐漸偏堿性,糖化酶的活性逐漸降低,生成還原糖的速率也逐漸減慢,又由于生成副產(chǎn)物造成部分還原糖的損失,引起產(chǎn)物中還原糖含量減少,DE值變小。因此,在后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中將選取糖化pH為4～6。

圖7 糖化pH對木薯淀粉糖化的影響Fig.7 The effect of pH on saccharification of cassava starch

2.1.7 料液比對木薯淀粉糖化的影響 料液比越小,糖化越完全,但產(chǎn)物較少;料液比越高,則糖化過程不能完全進(jìn)行,不但浪費(fèi)原料,而且使生產(chǎn)成本增加。由圖8可明顯看出,DE值先逐漸增大,在料液比為9∶20 g/mL時趨于平行。可能是:料液比從3∶20～9∶20 (g/mL),隨著原料的增加,液化醪濃度增大,酶與底物接觸更徹底,引起DE值逐漸增大;料液比從10∶20 (g/mL)后,DE值增大的趨勢不明顯,考慮到料液比的濃度過大及糖化的效果,因此,以9∶20 (g/mL)作為優(yōu)化糖化工藝參數(shù)的料液比。

圖8 料液比對木薯淀粉糖化的影響Fig.8 The effect of solid-liquid ratio on saccharification of cassava starch

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化木薯淀粉糖化工藝

2.2.1 Design Expert 8.0.6設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以Design Expert 8.0.6的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù),選取糖化時間、糖化溫度、糖化酶添加量以及糖化pH設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析方法,對木薯淀粉糖化工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 The response surface design of experimental results

2.2.2 回歸模型的建立與分析 表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Design Expert 8.0.6軟件對其進(jìn)行回歸分析,得回歸方程:

Y(%)=98.03-1.16A+1.05B+4.47C-5.33D-2.78AB-0.049AC-3.99AD+0.83BC-5.13BD-1.17CD-9.54A2-9.16B2-9.06C2-9.99D2

通過回歸模型分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)(表3)。由表3可以看出,模型p<0.0001,該模型極顯著;失擬項(xiàng)p=0.1218>0.05,失擬項(xiàng)不顯著;一次項(xiàng)(C、D)、二次項(xiàng)(A2、B2、C2、D2)、交互項(xiàng)(AD、BD)對木薯淀粉糖化的效果有極顯著影響；交互項(xiàng)AB對木薯淀粉糖化的效果有顯著影響。通過以上數(shù)據(jù)可以看出，該模型擬合程度良好,可以用此模型來描述各糖化條件與DE值之間的關(guān)系。

表3 模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

2.2.3 糖化工藝的響應(yīng)曲面分析和優(yōu)化 在響應(yīng)面分析中,若觀察某兩個因素同時對響應(yīng)值的影響可借助降維分析,即在其他因素條件固定在零水平的情況下,觀察兩個因素對響應(yīng)值的影響并得到影響的二次方程以及響應(yīng)面圖和等高線圖。響應(yīng)曲面圖能夠直觀的反映各因素對響應(yīng)值的影響,當(dāng)響應(yīng)曲面坡度陡峭,說明響應(yīng)值受變量交互作用明顯,反之,當(dāng)響應(yīng)曲面坡度平滑,則說明響應(yīng)值受各個變量變化的影響小。等高線圖能直觀反映因素交互作用對響應(yīng)值的影響,圓形表示因素間交互作用不明顯,橢圓形則表示交互作用顯著。根據(jù)木薯淀粉的DE值,考察糖化溫度、糖化時間、糖化酶添加量、糖化pH以及交互作用對木薯淀粉糖化的影響,如圖9～圖14所示。

由圖11、圖13可知,響應(yīng)曲面陡峭,表明糖化溫度和糖化pH、糖化時間和糖化pH交互作用對DE值的影響極顯著;由圖9的響應(yīng)曲面較陡峭，表明糖化溫度和糖化時間交互作用對DE值影響顯著。由圖10、圖12、圖14可知,響應(yīng)曲面較平緩,表明糖化溫度和糖化酶添加量、糖化時間和糖化酶添加量、糖化酶添加量和糖化pH交互作用對DE值的影響不顯著；與表3中的方差分析一致。

圖9 糖化溫度和糖化時間對木薯淀粉糖化影響的響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface plotshowing mutual influences of reaction temperature and reaction time on saccharification of cassava starch

圖10 糖化溫度和糖化酶添加量對木薯淀粉糖化影響的響應(yīng)曲面圖Fig.10 Response surface plotshowing mutual influences of reaction temperature and glucoamylase on saccharification of cassava starch

圖11 糖化溫度和糖化pH對木薯淀粉糖化影響的響應(yīng)曲面圖Fig.11 Response surface plotshowing mutual influences of reaction temperature and pH on saccharification of cassava starch

圖12 糖化時間和糖化酶添加量對木薯淀粉糖化影響的響應(yīng)曲面圖Fig.12 Response surface showing mutual influences of reaction time and glucoamylase on saccharification of cassava starch

圖13 糖化時間和糖化pH對木薯淀粉糖化影響的響應(yīng)曲面圖Fig.13 Response surface plotshowing mutual influences of reaction time and pH on saccharification of cassava starch

圖14 糖化酶添加量和糖化pH對木薯淀粉糖化影響的響應(yīng)曲面圖Fig.14 Response surface plotshowing mutual influences of glucoamylase and pH on saccharification of cassava starch

2.2.4 優(yōu)化提取參數(shù)和驗(yàn)證模型 經(jīng)分析得到最大響應(yīng)值與其相對應(yīng)的木薯淀粉糖化的最佳條件是:糖化溫度64.91 ℃,糖化時間101.63 min,糖化酶添加量5.27 g/L,糖化pH4.68。理論最佳糖化率為99.60%。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性,采用得到的最佳糖化條件進(jìn)行木薯淀粉糖化的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),同時考慮到實(shí)際操作和生產(chǎn)的便利,因此將木薯淀粉糖化的實(shí)驗(yàn)條件修訂為:糖化溫度65 ℃,糖化時間100 min,糖化酶添加量5 g/L,糖化pH4.7。經(jīng)過5次平行實(shí)驗(yàn),得到的實(shí)際糖化率為98.98%,表明經(jīng)優(yōu)化后的工藝條件能夠較好地預(yù)測木薯淀粉糖化工藝。

2.3 掃描電子顯微鏡(SEM)對木薯淀粉顆粒超聲前后的觀察

掃描電子顯微鏡對了解淀粉顆粒外部形貌具有強(qiáng)大的優(yōu)勢。由于其具有試樣容易制作、不因樣品表面復(fù)雜程度均可看到鮮明立體感的影像的特點(diǎn),所以被廣泛應(yīng)用于淀粉表面結(jié)構(gòu)研究方面[23]。

由圖15A可知,未經(jīng)超聲處理的木薯淀粉顆粒呈圓球型和橢圓形,表面光滑,無凹陷,具有一定的規(guī)整度,符合淀粉顆粒的微觀形貌。由圖15B可知,經(jīng)超聲波處理的木薯淀粉顆粒表面變得凹凸不平、出現(xiàn)凹陷,沒有一定的規(guī)整度。由兩組圖可以看出,木薯淀粉超聲前后有明顯的差異,這主要?dú)w因于超聲作用對木薯淀粉顆粒表層結(jié)構(gòu)的破壞。

圖15 未超聲處理(圖A)與超聲處理(圖B)的木薯淀粉SEM照片(3200×)Fig.15 SEM diagram of cassava starch without ultrasonic treatment(A)and ultrasonic treatment(B)(3200×)

2.4 FT-IR對木薯淀粉的檢測

由圖16可以看出,在3413.83 cm-1處有一個締合羥基(-OH)的強(qiáng)伸縮振動吸收峰;在2928.35 cm-1處有一個較強(qiáng)亞甲基(C-H)的對稱伸縮振動吸收峰,1408.44 cm-1處則為其變角振動吸收峰;而C-H的彎曲振動吸收峰在1636.82 cm-1出現(xiàn),幅度較強(qiáng);在1154～1022 cm-1范圍內(nèi),由于C-O鍵具有較大的極性,其紅外吸收峰較強(qiáng),故其吸收峰在1154.01 cm-1處出現(xiàn)。而1022 cm-1處的強(qiáng)吸收峰則說明了木薯淀粉具有吡喃型糖環(huán)。依據(jù)以上特征峰,可推斷木薯淀粉主要組成單糖為葡萄糖。

圖16 木薯淀粉的紅外光譜圖Fig.16 Infrared spectrum of cassava starch

2.5 GC-MS對糖化液中單糖組成的分析

在定性方面,GC-MS具有快速、特效的特點(diǎn)。借助GC-MS分析多糖,只需對樣品進(jìn)行衍生化后即可進(jìn)行測定。此方法快速、簡便、重現(xiàn)性好且穩(wěn)定可行,對分析樣品中的單糖組成具有明顯的優(yōu)勢[24]。

圖17是葡萄糖標(biāo)品、木薯淀粉糖化液及木薯淀粉乙酰化衍生產(chǎn)物的GC-MS圖譜。通過與葡萄糖標(biāo)品衍生化產(chǎn)物圖譜比對,確定木薯淀粉糖化液和木薯淀粉水解后的產(chǎn)物是葡萄糖,且成分單一。

圖17 葡萄糖標(biāo)品、木薯淀粉糖化液及木薯淀粉水解衍生產(chǎn)物色譜圖Fig.17 Chromatograms of hydrolyzed derivative of the glucose standard,the cassava starch saccharification liquid and the cassava starch

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以木薯淀粉為原料,以超聲時間、超聲功率、糖化時間、糖化溫度、糖化酶添加量、糖化pH、料液比為研究因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化并考慮到實(shí)際情況的可操控性,得到木薯淀粉糖化的最佳提取條件為:超聲時間15 min,超聲功率900 W,糖化溫度65 ℃,糖化時間100 min,糖化酶添加量5 g/L,糖化pH4.7,料液比9∶20 (g/mL)。經(jīng)過5次平行實(shí)驗(yàn),得到的實(shí)際平均糖化率DE為98.98%;掃描電子顯微鏡(SEM)結(jié)果顯示,木薯淀粉超聲前(表面光滑、具有一定的規(guī)整度)后(表面凹凸不平、沒有一定規(guī)整度)的形貌有差異;運(yùn)用GC-MS對木薯淀粉的單糖組分進(jìn)行分析表明,本實(shí)驗(yàn)條件下,木薯淀粉糖化后的產(chǎn)物為葡萄糖,且成分單一。

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