秦選吉,梁肖娜,穆易君,陳 洋,劉 崑,*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽(yáng) 110866)

羊肉是綠色蛋白的重要來(lái)源,倍受消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。我國(guó)是羊肉消費(fèi)大國(guó)[2],羊肉加工過(guò)程中可產(chǎn)生大量的羊肉下腳料如羊血、羊骨、羊皮、羊內(nèi)臟等[3]。經(jīng)研究,羊肉下腳料中含有人類所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如羊骨中含有豐富的鉀、鈣、鈉、鐵等微量礦物質(zhì)元素以及大量的膠原蛋白、氨基酸、多糖等生物活性物質(zhì)[4],羊血中含有18%左右的蛋白質(zhì)等[5]。

羊下腳料的應(yīng)用主要在飼料、林化工業(yè),而對(duì)于肥料等方面的研究較少。現(xiàn)今我國(guó)對(duì)羊肉下腳料的認(rèn)識(shí)與利用還不完善,大量資源被浪費(fèi),并且造成環(huán)境污染。

本實(shí)驗(yàn)以羊肉下腳料為原料,利用優(yōu)勢(shì)菌株X3枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、X17蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、M5為青霉菌屬(Penicilliumcitreonigrum)、M9米曲霉(Aspergillusoryzae)發(fā)酵羊肉部分下腳料,并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件,為羊肉下腳料的發(fā)酵應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肉部分下腳料(血、腸,肺,剔骨碎肉) 沈陽(yáng)市二臺(tái)子屠宰場(chǎng)提供;X3枯草芽孢桿菌、X17蠟樣芽孢桿菌、M5青霉菌屬 錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室從羊肉部分下腳料中分離篩選;M9米曲霉(商用菌種) 山東長(zhǎng)泰生物科技有限公司;定氮合金 天津盛鑫源化工公司；濃鹽酸、濃硫酸 沈陽(yáng)一化玻試劑有限公司。

TDL-5-A型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;ZHJH-1112型垂直流超凈工作臺(tái) 上海智城儀器有限公司;HZQ-F160A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;A800絞肉機(jī) 杭州九陽(yáng)股份有限公司；ATN-500全自動(dòng)凱氏定氮儀 上海庚庚儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊肉部分下腳料單株發(fā)酵效果測(cè)定 取新鮮羊肉部分下腳料,洗凈,用絞肉機(jī)攪成泥狀。稱5 g樣品按1∶10料水比,加入到250 mL錐形瓶中,121 ℃下滅菌20 min,無(wú)菌條件下將四株菌株種子液按10%的接種量分別接入四份樣品中,在溫度30 ℃、pH=7、轉(zhuǎn)速160 r/min培養(yǎng)7 d,結(jié)束后將發(fā)酵液在5000 r/min離心15 min,測(cè)發(fā)酵液中的總氮含量,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。以不接菌株為空白對(duì)照組(CK)。

1.2.2 羊肉部分下腳料混合菌株發(fā)酵效果測(cè)定 無(wú)菌條件將四株菌株種子液按等比混合,菌株混合組合如表1所示[6],操作方法同上述1.2.1。

表1 菌株等比混合組合Table 1 Strain combination

1.2.3 羊肉部分下腳料單因素發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 稱5 g樣品按1∶10料水比,加入到250 mL錐形瓶中,于121 ℃下滅菌20 min,滅菌后在無(wú)菌條件下分別將以上優(yōu)化的混合菌株接種到羊肉下腳料中,以溫度32 ℃、pH=6、接種量10%、轉(zhuǎn)速160 r/min為固定水平,考察各因素對(duì)下腳料中總氮含量的影響。各因素水平為溫度28、30、32、34、36 ℃,pH=4、5、6、7、8,接種量1%、5%、10%、15%、20%,轉(zhuǎn)速100、120、140、160、180 r/min,培養(yǎng)7 d后取出,發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液在5000 r/min離心15 min,測(cè)下腳料中總氮含量,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次[7]。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵羊肉部分下腳料實(shí)驗(yàn) 對(duì)發(fā)酵影響較大的溫度、pH、接種量、轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化,采用中心組合設(shè)計(jì)法,研究四個(gè)因素對(duì)發(fā)酵效果的影響,因素水平編碼見(jiàn)表2。

表2 Box Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 2 Factors and levels table of Box Behnken test

1.2.5 發(fā)酵后羊肉部分下腳料中總氮、磷、鉀含量測(cè)定 稱樣品0.1000～0.2000 g至250 mL蒸餾管中,加35 mL的蒸餾水使樣品溶解,再加1.0 g定氮合金、7 mL濃鹽酸到消化裝置中,加熱至150 ℃,取下消煮管冷卻到室溫后,加10 mL濃硫酸,繼續(xù)加熱到480 ℃消化,待消煮管中呈現(xiàn)藍(lán)色時(shí),取下消煮管冷卻至室溫,測(cè)氮含量[8]。磷、鉀含量測(cè)定參照章和珍等[9]、王治澤等[10]文獻(xiàn)中測(cè)定方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次平行測(cè)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用Excel、SPSS 17.0和Design-expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肉下部分腳料單株和混合菌株發(fā)酵效果

如圖1、圖2,與空白對(duì)照相比,單菌株和混合菌株發(fā)酵羊肉部分下腳料的效果均有顯著提高(p<0.05),其中單菌株X3和X17產(chǎn)生的總氮含量約是空白的1.5倍,混合組合7的混合菌株發(fā)酵后產(chǎn)生的總氮含量是空白的2.5倍,極顯著高于空白組(p<0.01),且產(chǎn)生的總氮含量均高于其他6組菌株組合且混合菌株條件下總氮含量高于單菌株,比較分析,確定組合7的混合菌株為發(fā)酵羊肉部分下腳料的最優(yōu)組合,即X3、X17、M5和M9以1∶1∶1∶1比例混合的混合菌株。

圖1 單菌株發(fā)酵液總氮含量的影響Fig.1 Effect of single strain fermentation on total nitrogen content

圖2 混合菌株發(fā)酵液總氮含量的影響Fig.2 Effect of mixed strain fermentation on total nitrogen content

2.2 羊肉部分下腳料單因素發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

2.2.1 溫度對(duì)羊肉部分下腳料發(fā)酵液總氮含量的影響 溫度是影響微生物發(fā)酵的重要因素,當(dāng)生長(zhǎng)溫度適中時(shí),微生物生長(zhǎng)迅速,酶類物質(zhì)代謝較快[11],如圖3發(fā)酵液溫度升到30 ℃時(shí),總氮含量迅速增加至最大值,約為31.04 mg/mL,溫度繼續(xù)增加,總氮含量遞減,可能隨溫度的升高,微生物活動(dòng)能力下降甚至喪失,因此發(fā)酵的最佳溫度為30 ℃。

圖3 溫度對(duì)羊肉部分下腳料發(fā)酵液總氮含量的影響Fig.3 Effect of temperature on the fermentation fluid total nitrogen content of mutton offal

2.2.2 pH對(duì)羊肉部分下腳料發(fā)酵液總氮含量的影響 微生物在適宜的pH才正常生存,促進(jìn)微生物的活動(dòng),反之將阻礙代謝。如圖4發(fā)酵液中總氮含量隨pH增大而增大,pH為6時(shí),總氮含量達(dá)到最高值約為27.93 mg/mL,之后隨pH增大,總氮含量降低,可能pH為6時(shí),是混合菌株的最適生長(zhǎng)pH,代謝較旺盛,產(chǎn)生的總氮含量最高,因此pH=6為最佳。

圖4 pH對(duì)羊肉部分下腳料發(fā)酵液總氮含量的影響Fig.4 Effect of pH on the fermentation fluid total nitrogen content of mutton offal

2.2.3 接種量對(duì)羊肉部分下腳料發(fā)酵液總氮含量的影響 圖5隨接種量增加,總氮含量上升,當(dāng)接種量為10%時(shí)總氮含量達(dá)到最大。隨接種量繼續(xù)加大,總氮含量降低。原因可能是適合的接種量可促使微生物從底料中獲得營(yíng)養(yǎng)來(lái)維持生長(zhǎng)代謝,但接種少時(shí),微生物的數(shù)量少發(fā)酵效果不好,相反較大時(shí),底料中營(yíng)養(yǎng)不能滿足微生物生長(zhǎng)代謝,因此最佳接種量為10%。

圖5 接種量對(duì)羊肉部分下腳料發(fā)酵液總氮含量的影響Fig.5 Effect of inoculum on the fermentation fluid total nitrogen content of mutton offal

2.2.4 轉(zhuǎn)速對(duì)羊肉下部分腳料發(fā)酵液總氮含量的影響 轉(zhuǎn)速影響微生物供氧量的需求。圖6中隨轉(zhuǎn)速的增大,總氮含量不斷增加,當(dāng)轉(zhuǎn)速160 r/min時(shí),含量最高約為29.27 mg/mL,可能是轉(zhuǎn)速增加,發(fā)酵液流體程度加大,氣相間的傳質(zhì)和液相間的傳質(zhì)過(guò)程加快,供氧量增多,微生物活動(dòng)增強(qiáng)發(fā)酵效果較好[12],但轉(zhuǎn)速繼續(xù)上升,總氮含量下降,因此適合的轉(zhuǎn)速為160 r/min。

圖6 轉(zhuǎn)速對(duì)羊肉部分下腳料發(fā)酵液總氮含量的影響Fig.6 Effect of speed on the fermentation fluid total nitrogen content of mutton offal

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵羊肉部分下腳料發(fā)酵工藝

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵羊肉部分下腳料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)羊肉部分下腳料發(fā)酵效果影響明顯的因素(溫度、pH、接種量、轉(zhuǎn)速)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果表3所示。利用Design Expert 8.0.6對(duì)表3中的響應(yīng)值進(jìn)行回歸擬合多重分析比較,考察各因素水平對(duì)發(fā)酵的效果影響,得到如下回歸方程:Y=34.86+2.40A-1.80B+2.54C-0.45D-3.11AB-5.31AC-2.92AD+7.33BC+1.11BD-1.41CD-7.06A2-7.24B2-5.19C2-14.66D2。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface analysis test

由表4可知,模型p<0.0001,模型項(xiàng)達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明模型可靠;失擬項(xiàng)p=0.9734>0.05,說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著;一次項(xiàng)A、C,交互項(xiàng)AB、BC和二次項(xiàng)A2、D2達(dá)到極顯著水平(p<0.0001);一次項(xiàng)B，交互項(xiàng)AD達(dá)到顯著水平(p<0.05);下腳料中總氮含量的影響順序依次為:接種量>溫度>pH>轉(zhuǎn)速,即接種量對(duì)于總氮含量的影響較為顯著。

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis of regression equation

2.3.2 響應(yīng)面各因素交互作用分析 如圖7所示,溫度和pH之間交互作用對(duì)總氮含量影響極顯著,同時(shí)響應(yīng)曲面形成的最高點(diǎn)是等高線圖中心點(diǎn);而圖8中,溫度和接種量的曲面變化幅度小,說(shuō)明兩因素的交互作用對(duì)總氮含量的影響不大,與表4中回歸擬合方差分析一致;圖9中,曲面坡度較陡,等高線呈橢圓,溫度與轉(zhuǎn)速的交互作用對(duì)總氮含量影響顯著;圖10 中,pH和接種量的響應(yīng)曲面變化幅度較大,pH和接種量對(duì)總氮含量的影響極顯著(p<0.001);圖11中,pH和轉(zhuǎn)速曲面變化不大,對(duì)總氮含量影響小,作用不顯著;圖12中,接種量與轉(zhuǎn)速兩因素對(duì)總氮含量的交互作用不顯著,但接種量對(duì)總氮含量的影響略高于轉(zhuǎn)速。

圖7 溫度和pH對(duì)總氮含量的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface of temperature and pH on total nitrogen content

圖8 溫度和接種量對(duì)總氮含量的響應(yīng)曲面圖Fig.8 Response surface of temperature and inoculum on total nitrogen content

圖9 溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)總氮含量的響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface of temperature and speed on total nitrogen content

圖10 pH和接種量對(duì)總氮含量的響應(yīng)曲面圖Fig.10 Response surface of pH and inoculum ontotal nitrogen content

圖11 pH和轉(zhuǎn)速對(duì)總氮含量的響應(yīng)曲面圖Fig.11 Response surface of pH and speed on total nitrogen content

圖12 接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)總氮含量的響應(yīng)曲面圖Fig.12 Response surface of inoculum and speed on total nitrogen content

2.3.3 模型驗(yàn)證 數(shù)據(jù)分析采用Design Expert 8.0.6軟件,根據(jù)Box Benhnken(BBD)和二次回歸方程分析,得到羊肉部分下腳料發(fā)酵工藝的最佳條件為:溫度30.4 ℃,pH=5.86,接種量10.06%,轉(zhuǎn)速160 r/min,此優(yōu)化條件下得到理論值為37.84 mg/mL?？紤]實(shí)驗(yàn)設(shè)備的精準(zhǔn)性,確定最佳條件為:溫度30 ℃,pH=6.0,總接種量10%,轉(zhuǎn)速160 r/min。在此條件下進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),最終得到實(shí)際平均值為37.16 mg/mL,與理論值接近,可說(shuō)明該模型下的羊肉部分下腳料發(fā)酵最佳工藝條件具有實(shí)際可操作性。

2.4 發(fā)酵羊肉部分下腳料理化指標(biāo)測(cè)定

為檢驗(yàn)發(fā)酵后羊肉部分下腳料在肥料方面的價(jià)值,測(cè)得在最佳發(fā)酵條件下的發(fā)酵羊肉中的氮、磷、鉀含量分別為(37.16±1.78)、(12.4±0.06)、(11.7±0.08) mg/mL,即總養(yǎng)分(N+P2O5+K2O)含量為6.126%,符合國(guó)家規(guī)定的復(fù)合肥料的總養(yǎng)分含量(NYT 798-2015)[15]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以羊肉部分下腳料為原料,利用優(yōu)良菌株發(fā)酵,進(jìn)行單菌株和混合菌株實(shí)驗(yàn)，得到混合菌株組合7效果最好，采用響應(yīng)面法優(yōu)化羊肉部分下腳料發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,得到溫度、pH、接種量和轉(zhuǎn)速的回歸模型,并對(duì)方程求解,得到羊肉部分下腳料發(fā)酵最優(yōu)條件為溫度30 ℃,pH=6.0,接種量10%,轉(zhuǎn)速160 r/min,在優(yōu)化條件下重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)后得到的總氮含量約為37.16 mg/mL。其發(fā)酵的最佳條件將會(huì)對(duì)羊肉等畜產(chǎn)品的綜合利用提供一定的理論參考。

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