馬耀宏,馬潤(rùn)隆,鄭 嵐,*,楊 艷,楊俊慧,蔡 雷,劉慶艾,莊曉鳳,王業(yè)強(qiáng)

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院),山東省科學(xué)院生物研究所, 山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250103; 2.山東師范大學(xué)附屬中學(xué),山東濟(jì)南 250014)

平陰縣是我國著名的“玫瑰之鄉(xiāng)”,因花色艷麗、瓣多而厚、香氣濃郁,而享譽(yù)世界[1-3]。目前,平陰玫瑰花產(chǎn)品不僅包括傳統(tǒng)的玫瑰干花瓣、玫瑰茶、玫瑰花醬、玫瑰餡料、玫瑰糖等初加工產(chǎn)品,先后開發(fā)了玫瑰精油、玫瑰細(xì)胞液、玫瑰超微粉、玫瑰保健品、玫瑰化妝品等多種精深加工產(chǎn)品[4]。隨著平陰玫瑰產(chǎn)業(yè)的發(fā)展壯大,玫瑰種植面積已達(dá)5萬畝,年產(chǎn)鮮花8000余t[5]。由于玫瑰花瓣是制作玫瑰食品、玫瑰細(xì)胞液、玫瑰超微粉等多種玫瑰產(chǎn)品的原材料,所以新鮮玫瑰花采摘后首先需要進(jìn)行花瓣分選環(huán)節(jié)[6],從而產(chǎn)生了大量玫瑰花托廢棄物,造成了玫瑰花資源的極大浪費(fèi)。玫瑰花是深受消費(fèi)者青睞的食藥用珍惜資源,如何有效的利用玫瑰花托是玫瑰產(chǎn)業(yè)急需解決的問題。

玫瑰花具有理氣、活血、美容養(yǎng)顏、收斂等作用,主治月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷、肝氣胃痛、乳臃腫痛等癥[7-9]。多糖是食品、醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的生理活性物質(zhì),具有特定的保健功效[10],玫瑰花的主要功效成分是玫瑰花多糖[11-12],近年來對(duì)于玫瑰花多糖的提取工藝及其結(jié)構(gòu)、活性已經(jīng)進(jìn)行了初步探索,但是對(duì)于玫瑰花托的研究還未見報(bào)道。本研究分別提取純化玫瑰花瓣及花托多糖,將其結(jié)構(gòu)特征和抗氧化活性進(jìn)行對(duì)比分析,從而為玫瑰花托提供新的研發(fā)角度和研發(fā)依據(jù),這對(duì)于平陰玫瑰資源的綜合利用以及玫瑰產(chǎn)業(yè)鏈的延長(zhǎng)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平陰玫瑰花 由濟(jì)南惠農(nóng)玫瑰花精油有限公司提供;乙腈(色譜純) 美國Fisher公司;標(biāo)準(zhǔn)單糖(葡萄糖、甘露糖、鼠李唐、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP) 美國Sigma公司;溴化鉀碎晶 美國Thermo公司;DEAE-52纖維素 英國whatman公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

LE204E型電子天平 特勒-托利多(Mettler Toledo)公司;JP-800C-6型中藥粉碎機(jī) 永康市久品工貿(mào)有限公司;SBS型數(shù)控記滴自動(dòng)部分收集器、DHL-A型電腦數(shù)顯恒流泵 上海滬西儀器廠有限公司;凍干機(jī) 沈陽航天速凍設(shè)備制造有限公司;Spectra MR型酶標(biāo)儀 美國Dynex公司;Agilent1260型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司(Agilent Technologies);Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 美國沃特斯公司;Thermo-Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Scientific)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玫瑰花瓣及花托多糖的提取 將玫瑰的花瓣和花托分離,分別置于55 ℃烘箱中烘干,于中藥粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎,并過80目篩。分別取玫瑰花瓣、花托粉末,將其與去離子水以1∶20比例混合,超聲波破碎(超聲功率為300 W,超聲時(shí)間為15 min),然后置于90 ℃水浴中2 h,離心(15000 r/min,10 min,4 ℃)取上清液[13]。按上述步驟提取3次,合并上清液。將玫瑰多糖提取液減壓濃縮至合適濃度,加入兩倍體積95%乙醇,靜置過夜,離心(15000 r/min,10 min,4 ℃),沉淀于55 ℃烘箱中烘干,并粉碎,獲得玫瑰花瓣及花托粗多糖。

1.2.2 玫瑰花瓣及花托多糖的純化

1.2.2.1 除色素 將粗多糖溶于適量去離子水中,按1%(m/v)比例加入活性炭,攪拌60 min,離心(14000 r/min,15 min)取上清液。

1.2.2.2 除蛋白 采用Sevag法除蛋白,按4∶1的體積加入Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=5∶1,v/v),充分振搖15 min,離心(8000 r/min,10 min),除去有機(jī)相及有機(jī)相與水相交界處的白色乳化層。如此重復(fù)10次,至乳化層消失為止,凍干待用,并分別命名為玫瑰花瓣多糖(RRP)及玫瑰花托多糖(RRR)。RRP或RRR的得率(%)=RRP或RRR的質(zhì)量(g)/花瓣或花托粉末的質(zhì)量(g)×100。

1.2.2.3 DEAE-52纖維素陰離子交換柱層析 將去蛋白后的RRP及RRR溶于適量去離子水中,用0.45 μm的微孔濾膜過濾,加5 mL樣品溶液于DEAE-52纖維素陰離子交換柱(2.6 cm×30 cm)中,用去離子水和0.05、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫,洗脫液的流速為1 mL/min。用全自動(dòng)部分收集器收集洗脫液(2 mL/管),用苯酚-硫酸法逐管檢測(cè),以管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度(A490 nm)為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。并將各洗脫組分凍干待用。組分的得率(%)=組分的質(zhì)量(g)/RRP或RRR的質(zhì)量(g)×100。

1.2.2.4 純度鑒定 用酶標(biāo)儀對(duì)200～400 nm波段進(jìn)行掃描,觀察280 nm處有無吸收峰來檢測(cè)蛋白是否去除干凈。

1.2.3 傅立葉紅外光譜(FT-IR)分析 取干燥的多糖樣品與KBr一起研磨均勻,用壓片模具制成透明薄片,用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜測(cè)定,掃描范圍:4000～400 cm-1,分辨率:4 cm-1。

1.2.4 單糖組成分析 采用柱前衍生高效液相色譜法(HPLC)分析RRP、RRR及其組分的單糖組成。

1.2.4.1 多糖的水解 準(zhǔn)確稱取待測(cè)樣品0.05 g于試管中,加入10 mL H2SO4(1 mol/L),封口并置于沸水浴中水解8 h。水解結(jié)束后,將水解液離心(10000 r/min,10 min,4 ℃),取上清液4.5 mL用NaOH(2 mol/L)中和至pH為7,并定容至10 mL,離心(10000 r/min,10 min,4 ℃)后取上清液待衍生化。

1.2.4.2 多糖的衍生化 分別取50 μL待測(cè)樣品及7種單糖(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖)的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(2 mmol/L)與50 μL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液(0.5 mol/L)及50 μL NaOH(0.3 mol/L)混合均勻,將混合液置于恒溫水浴鍋中70 ℃反應(yīng)30 min,冷卻至室溫后,加入50 μL HCl(0.3 mol/L)進(jìn)行中和并加入100 μL高純水進(jìn)行稀釋?；靹蚝笙蚧旌弦褐屑尤?00 μL氯仿,渦旋混勻30 s隨后靜置5 min,吸取下層液棄去。重復(fù)操作3次,即得衍生化的樣品。每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),用0.45 μm的微孔濾膜過濾,隨后進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.2.4.3 高效液相色譜條件 流動(dòng)相:醋酸銨緩沖溶液(pH5.5)-乙腈(77∶23,v/v);柱溫:25 ℃;流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):245 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

1.2.5 體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 羥基自由基清除能力 采用Fenton法進(jìn)行羥基自由基清除能力的測(cè)定。將1 mL硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L),1 mL水楊酸乙醇溶液(9 mmol/L),1 mL多糖樣品溶液和1 mL過氧化氫溶液(8.8 mmol/L)于試管中混合均勻,37 ℃水浴30 min。離心(5000 r/min,10 min)后取上清液于510 nm處測(cè)定吸光度,并用BHT作為陽性對(duì)照。按照以下公式計(jì)算羥基自由基清除率(Scavenging rate,SR),SR(%)=(A0-A)/A0×100。其中,A0是去離子水+過氧化氫的吸光度,A是樣品+過氧化氫的吸光度。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力 取2 mL多糖樣品溶液于試管中,加入2 mL DPPH乙醇溶液(0.2 mmol/L),混合均勻后避光反應(yīng)30 min,然后在517 nm處測(cè)定其吸光度,用BHT作為為陽性對(duì)照。清除能力SR(%)=[1-(A-A0)/A1]×100。其中,A為2 mL樣品溶液與2 mL DPPH乙醇溶液混合液的吸光度,A0為2 mL乙醇與2 mL樣品溶液混合液的吸光度,A1為2 mL去離子水與2 mL DPPH乙醇溶液混合液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件作圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,p<0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

苯酚-硫酸法的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of phenol-sulfuric acid method

由圖1可見,苯酚硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.0085x-0.0055,R2=0.9993。玫瑰花瓣和玫瑰花托粉末中RRP和RRR的得率分別為3.22%和3.78%。RRP和RRR的多糖含量分別為94.12%和93.75%。

2.2 洗脫曲線

RRP和RRR的DEAE-52纖維素陰離子交換柱洗脫曲線見圖2、圖3。

圖2 RRP的DEAE-52纖維素離子交換柱洗脫曲線Fig.2 Elution curve of RRP on DEAE-52 cellulose column

圖3 RRR的DEAE-52纖維素離子交換柱洗脫曲線Fig.3 Elution curve of RRR on DEAE-52 cellulose column

由圖2、圖3可見,RRR、RRP的DEAE-52纖維素陰離子交換柱洗脫曲線較為相似,分別可以獲得三個(gè)組分,這3個(gè)組分命名為RRP-1、RRP-2、RRP-3和RRR-1、RRR-2、RRR-3,由去離子水、0.05 mol/L NaCl、0.1 mol/L NaCl洗脫獲得。RRP-1、RRP-2和RRP-3的得率分別為38.67%、29.03%、22.16%,RRR-1、RRR-2和RRR-3的得率分別為36.69%、24.48%、23.12%。

2.3 紫外掃描光譜

RRP及其組分(RRP-1,RRP-2和RRP-3)、RRR及其組分(RRR-1,RRR-2和RRR-3)的紫外掃描光譜見圖4。

圖4 紫外掃描曲線Fig.4 UV scanning spectrum注:A:RRP及其組分;B:RRR及其組分。

由圖4可見,RRP及其組分(RRP-1、RRP-2和RRP-3)和RRR及其組分(RRR-1、RRR-2和RRR-3)在280 nm處沒有吸收峰,說明蛋白質(zhì)已經(jīng)去除干凈。

2.4 FT-IR測(cè)定結(jié)果

RRP及其組分(RRP-1、RRP-2、RRP-3)、RRR及其組分(RRR-1、RRR-2、RRR-3)的FT-IR光譜圖見圖5和圖6。

圖5 FT-IR光譜圖Fig.5 FT-IR spectrum 注:A:RRP;B:RRP-1;C:RRP-2;D:RRP-3。

圖6 FT-IR光譜圖Fig.6 FT-IR spectrum注:A:RRR;B:RRR-1;C:RRR-2;D:RRR-3。

由圖5和圖6可見,RRP、RRR及其組分具有多糖的一般特征峰。在3500～3000 cm-1處的強(qiáng)寬吸收峰為O-H鍵伸縮振動(dòng)形成。2900 cm-1附近處的吸收峰為C-H鍵伸縮振動(dòng)峰。1735 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是-COOH的C=O伸縮振動(dòng),可以說明糖醛酸的存在。在1616 cm-1處的吸收峰表明有C=O的伸縮振動(dòng)。1400～1200 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰表明有C-H邊角振動(dòng)。在1200～1000 cm-1處的吸收峰是由糖環(huán)振動(dòng),C-OH側(cè)基的伸縮振動(dòng),C-O-C糖苷鍵振動(dòng)相疊加所致。1100 cm-1處的吸收峰是C-O鍵伸縮振動(dòng)形成的。FT-IR可以確定糖苷鍵的構(gòu)型,糖α-和β-的端基差向異構(gòu)體是由端基的C-H變角振動(dòng)造成的,在吡喃糖苷鍵的構(gòu)型中,α-型異構(gòu)體C-H為平伏鍵,在(844±8) cm-1處有特征吸收峰,而β-型異構(gòu)體C-H為直立鍵,在(891±7) cm-1處有特征吸收峰。另外,吡喃糖在1020～1180 cm-1處出現(xiàn)三個(gè)吸收峰,而呋喃糖在同一區(qū)域只出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰。因此,RRP的構(gòu)型主要為呋喃糖;RRP-1的構(gòu)型為呋喃糖;RRP-2的構(gòu)型為α-糖苷鍵連接的吡喃糖;RRP-3的構(gòu)型為α-糖苷鍵連接的吡喃糖;RRR的構(gòu)型主要為呋喃糖;RRR-1的構(gòu)型為呋喃糖;RRR-2的構(gòu)型為呋喃糖;RRR-3的構(gòu)型為α-糖苷鍵連接的吡喃糖。RRP和RRR可以觀察到1735 cm-1左右的糖醛酸特征峰。

由此可見,RRR和RRP、RRR-1和RRP-1、RRR-3和RRP-3有著相同的構(gòu)型,但是RRR-2和RRP-2的構(gòu)型不同。

2.5 單糖組成

RRP及其組分(RRP-1,RRP-2、RRP-3)、RRR及其組分(RRR-1、RRR-2、RRR-3)的單糖組成見表1。

表1 單糖組成的摩爾比例關(guān)系Table 1 Mole ratio of monosaccharide composition

由表1可見,RRP含有7種單糖,其中葡萄糖含量最高,其次為阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸,而鼠李糖、葡萄糖醛酸、甘露糖含量較低。RRP-1含有4種單糖,葡萄糖是RRP-1的主要組分,而阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖的含量較低。RRP-2含有5種單糖,其中半乳糖含量最高,其次為阿拉伯糖、葡萄糖醛酸。RRP-3含有6種單糖,其中半乳糖含量最高,其次為半乳糖醛酸和阿拉伯糖。

RRR含有7種單糖,其中葡萄糖含量最高,其次為阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸,而鼠李糖、葡萄糖醛酸、甘露糖含量較低。RRR-1含有4種單糖,葡萄糖是其主要成分。RRR-2含有6種單糖,半乳糖是其主要成分,其次為阿拉伯糖、葡萄糖。RRR-3含有6種單糖,其中半乳糖醛酸含量最高,其次為半乳糖和葡萄糖。

因此,RRR和RRP由相同種類的單糖構(gòu)成,但是各種單糖之間的摩爾比例關(guān)系不同。純化組分中RRR-1和RRP-1、RRR-3和RRP-3由相同種類的單糖構(gòu)成,RRR-2和RRP-2由不同種類的單糖構(gòu)成。

2.6 體外抗氧化能力分析

2.6.1 RRP及其組分的體外抗氧化能力 RRP及其組分RRP-1、RRP-2、RRP-3的羥基自由基和DPPH自由基的清除能力見圖7。

圖7 RRP及其組分RRP-1、RRP-2、RRP-3的抗氧化能力Fig.7 Anti-oxidant activities of RRP, RRP-1,RRP-2 and RRP-3 注:A:羥基自由基的清除能力;B:DPPH自由基的清除能力。

羥基自由基在體內(nèi)的化學(xué)性質(zhì)非?；顫?是一種危害性大、破壞性強(qiáng)的活性氧自由基。由圖7A可知,RRP及其組分RRP-1、RRP-2、RRP-3的羥基自由基清除能力呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。自由基的清除能力以EC50值表示,EC50值代表清除50%自由基的樣品濃度。RRP、RRP-1、RRP-2、RRP-3以及BHT的EC50值分別為725.20、540.95、771.79、657.06、624.23 mg/L,此時(shí)羥基自由基清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)镽RP-1>BHT>RRP-3>RRP>RRP-2。而當(dāng)多糖濃度達(dá)到1600 mg/L時(shí),強(qiáng)弱順序變?yōu)锽HT=RRP>RRP-3>RRP-1>RRP-2。

DPPH是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,廣泛應(yīng)用于抗氧化物質(zhì)的體外評(píng)價(jià)。由圖7B可知,隨著多糖樣品濃度的增加,DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。RRP、RRP-1、RRP-2、RRP-3以及BHT的EC50值分別為552.82、673.61、714.62、469.06、463.87 mg/L。因此,DPPH自由基清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)锽HT>RRP-3>RRP>RRP-1>RRP-2。

2.6.2 RRR及其組分的體外抗氧化能力 RRR及其組分RRR-1、RRR-2、RRR-3的羥基自由基和DPPH自由基的清除能力見圖8。

圖8 RRR及其組分RRR-1、RRR-2、RRR-3的抗氧化能力Fig.8 Anti-oxidant activities of RRR, RRR-1,RRR-2 and RRR-3注:A:羥基自由基的清除能力;B:DPPH自由基的清除能力。

由圖8A可知,RRR及其組分RRR-1、RRR-2、RRR-3的羥基自由基清除能力呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。RRR、RRR-1、RRR-2、RRR-3以及BHT的EC50值分別為699.46、778.25、1017.65、695.69、624.23 mg/L,此時(shí)羥基自由基清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)锽HT>RRR-3>RRR>RRR-1>RRR-2。而當(dāng)多糖濃度達(dá)到1600 mg/L時(shí),強(qiáng)弱順序變?yōu)镽RR>BHT>RRR-3>RRR-1>RRR-2。

由圖8B可知,隨著多糖樣品濃度的增加,DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。RRR、RRR-1、RRR-2、RRR-3以及BHT的EC50值分別為514.31、722.45、789.23、600.15、463.87 mg/L。因此,DPPH自由基清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)锽HT>RRR>RRR-3>RRR-1>RRR-2。

抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RRP及其組分(RRP-1、RRP-2、RRP-3)、RRR及其組分(RRR-1、RRR-2、RRR-3)具備良好的體外抗氧化能力。RRR的抗氧化活性稍強(qiáng)于RRP。

3 結(jié)論

本研究分別將平陰玫瑰花瓣多糖(RRP)和花托多糖(RRR)分離純化為3個(gè)組分(RRP-1、RRP-2、RRP-3和RRR-1、RRR-2、RRR-3),并進(jìn)行結(jié)構(gòu)和抗氧化能力的對(duì)比分析。結(jié)構(gòu)分析表明RRR的單糖組成為葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖醛酸、甘露糖(24.01∶14.57∶11.50∶9.77∶5.5∶1.09∶1),構(gòu)型主要為呋喃糖。RRR和RRP由相同種類的單糖構(gòu)成,但是各種單糖之間的摩爾比例關(guān)系不同。純化組分中RRR-1和RRP-1、RRR-3和RRP-3由相同種類的單糖構(gòu)成,并且構(gòu)型相同。RRR-2和RRP-2的結(jié)構(gòu)略有差異?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)表明,RRR和RRP均具有較強(qiáng)的抗氧化活性,RRR清除羥基自由基和DPPH自由基的EC50值分別為699.46、514.31 mg/L。因此,平陰玫瑰花托多糖具有良好的抗氧化特性,可以開發(fā)成為抗衰老保健食品及玫瑰化妝品。

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