董 蕊,孫昌霞

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長春 130118)

傳統(tǒng)中藥木賊為木賊科植物木賊(EquisetumhiemaleL.)干燥地上部分,是現(xiàn)今唯一被載入《中國藥典》[1]的木賊屬植物。主產(chǎn)于東北、華北、內(nèi)蒙古等地區(qū)[2]。迄今,木賊科植物有30多種,中國有9種,長白山地區(qū)產(chǎn)6種,分別為木賊(E.hiemaleL.)、問荊(E.arvense)、犬問荊(E.palustr)、草問荊(E.pratense)、節(jié)節(jié)草(E.ramosissimum)等[3]。主治風(fēng)熱目赤、目生云翳、月經(jīng)過多、脫肛及腸風(fēng)下血等癥,是歷史悠久的傳統(tǒng)中藥。

國內(nèi)外學(xué)者對木賊屬植物化學(xué)成分及藥理作用已開展研究,現(xiàn)已分離出30余種黃酮類成分[4],檢測出酚酸類、生物堿、酯類及無機物等[5]。楊波等[6]發(fā)現(xiàn)中藥木賊(E.hiemaleL.)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有治療作用,可改善動脈粥樣硬化[7],抗氧化[8]、抗衰老[9]、抗血拴、降血脂、降血糖[10]、利尿、抗菌抗病毒[11]等,該藥還能有效抑制人宮頸癌Hela細胞[12],減少食餌性脂肪肝的發(fā)生[13-14]。付影超[15]探討了同屬植物節(jié)節(jié)草中總黃酮的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)其清除DPPH·能力隨總黃酮含量增高而增強;劉勝利[16]研究木賊水煎液對老齡小鼠的抗氧化作用,發(fā)現(xiàn)該提取液具有清除小鼠體內(nèi)自由基作用,能延緩衰老,但對其治病機理并沒有深入追蹤。

目前,《中國藥典》記載的木賊的化學(xué)成分和藥理作用研究得還不夠深入,本文通過對木賊醇提取物采用有機溶劑萃取得到的不同萃取物進行自由基清除能力測試,探究其抗氧化活性,旨在深度開發(fā)木賊資源提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木賊 于2016年10月采自吉林省長白山地區(qū),經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭毅男教授鑒定為木賊科植物木賊(EquisetumhyemaleL.)。自然陰干后粉碎,過80目篩,備用；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、鹽酸、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、雙氧水、水楊酸、硫酸亞鐵等 均為北京化工廠分析純；蘆丁、阿魏酸、抗壞血酸 上海金穗生物科技有限公司,純度≥98%;2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+·)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)南京奧多福尼生物科技有限公司,純度>98%;福林酚 上海金穗生物科技有限公司。

R1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司;HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;T6紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;SPECTROstar Nano BMG LRBTECH;96孔板 Corning Incorporated;DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 取10 kg干粉,以料液比(1∶12)70%乙醇在400 W功率下超聲40 min,提取溫度40 ℃,提取3次[8,12],減壓回收乙醇,冷凍干燥得總提物1.26 kg。取1 kg總提物,蒸餾水5 L溶解,以等體積石油醚萃取3次,取上層石油醚溶液共15 L,減壓回收石油醚,得石油醚相(241 g);剩余下層水溶液水浴揮盡石油醚,以等體積乙酸乙酯萃取3次,取上層萃取液(15 L)減壓回收乙酸乙酯,得乙酸乙酯相(31 g),相同操作得正丁醇相(200 g),剩余水層冷凍干燥得水相(517 g),干燥至恒重,備用。

1.2.2 總酚酸、總黃酮含量測定

1.2.2.1 總黃酮含量的測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[17]測木賊不同萃取部位總黃酮含量。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg,95%乙醇配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL于10 mL容量瓶中,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL,混勻,室溫下放置6 min,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液0.3 mL,混勻,室溫放置6 min,加4%氫氧化鈉4 mL,加95%乙醇至刻度,混勻,室溫靜置15 min,以95% 乙醇作空白対照液,于510 nm 波長下測吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立回歸方程。

樣品測定:取10.0 mg 木賊醇提物不同萃取部位樣品,配置為1 mg/mL供試液,方法同1.2.2.1利用回歸方程計算黃酮含量。

1.2.2.2 總酚酸含量測定 各萃取物中總酚酸含量的測定采用Folin-Ciocalteu法[18-21]并加以改進。

阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精密稱取2.5 mg 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品,配成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取3 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液,加入1 mL Folin-Ciocalteu 顯色劑,混勻,加入0.5 mol/mL碳酸鈉水溶液5 mL。蒸餾水定容至10 mL,混勻,室溫避光1 h,于760 nm 波長處測吸光度。以阿魏酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立回歸方程。

取1.2.2.1項下供試液,按上述方法測木賊醇提物不同萃取部位樣品吸光度值,通過回歸方程得各樣品總酚酸含量。

1.2.3 抗氧化活性測定

1.2.3.1 還原能力的測定 精密量取質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL抗壞血酸與不同萃取部位供試液各1 mL,依次加入pH6.6磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL,1%鐵氰化鉀2.5 mL,搖勻,50 ℃水浴20 min,加入10%三氯乙酸2.5 mL,混勻后4500 r/min離心10 min,取上清液5 mL,加入5 mL 蒸餾水,最后加入0.1%三氯化鐵1 mL,靜置10 min后于700 nm波長處測吸光度值。每個試樣重復(fù)3次[22]。

1.2.3.2 對羥自由基(·OH)清除能力 精密量取1.2.3.1項下不同濃度抗壞血酸與不同萃取物供試液1 mL。通過Fenten反應(yīng)[23]按下述步驟測定各供試液對羥自由基的清除能力:取6 mmol/L硫酸亞鐵1 mL,6 mmol/L水楊酸1 mL,不同濃度的供試液1 mL,最后加8.8 mmol/L H2O21 mL啟動反應(yīng),37 ℃反應(yīng)30 min,以蒸餾水為參比,510 nm處測各濃度的吸光度。通過公式計算木賊醇提取物不同萃取部位·OH清除率:

清除率(%)=[A0-(Ai-Ai0)]/A0×100

式中：A0:以蒸餾水代替供試品的吸光度;Ai:加入供試品溶液后的吸光度;Ai0:不加顯色劑(H2O2)供試品溶液的本底吸光度。

1.2.3.3 對DPPH自由基清除能力 精密量取1.2.3.1項下不同濃度抗壞血酸與木賊醇提物不同萃取部位供試液100 μL于96孔板中,加入100 μL DPPH·(濃度0.2 mmol/L)甲醇溶液,避光靜置30 min,在517 nm處測其吸光度[24-25]。根據(jù)公式計算DPPH·自由基的清除率:

清除率(%)=[A0-(Ai-Ai0)]/A0×100

其中,A0:不加供試品DPPH·甲醇吸光度值;Ai:加入供試品與DPPH·甲醇吸光度值;Ai0:供試品的本底吸光度值。

1.2.3.4 對ABTS+自由基清除能力 按照參考文獻[26-27]配置A液:精密稱取0.0384 g ABTS蒸餾水定容于10 mL容量瓶中;B液:精密稱取0.0134 g過硫酸鉀蒸餾水定容到10 mL容量瓶中。將A液與B液1∶1混合,避光12～16 h得ABTS+·儲備液,使用前加pH7.4 的PBS 液稀釋至吸光度值0.7～0.8,備用。

精密量取1.2.3.1項下不同濃度抗壞血酸與木賊醇提物不同萃取部位供試液40 μL于96孔板中,加入稀釋后的ABTS+·儲備液160 μL,在734 nm波長處測定其吸光度值。取供試液溶劑40 μL與96孔板中,加入160 μL稀釋后的ABTS+·儲備液,測吸光度值,做空白對照。ABTS+自由基的清除率為:

清除率(%)=(1-A樣品/A空白)×100

其中,A樣品:供試品溶液與ABTS+·的吸光值度;A空白:供試品溶劑與ABTS+·的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均平行測定3次,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS軟件里Duncan’s multiple range test 進行樣本間差異顯著性分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1所示,以濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得蘆丁回歸方程:y=12.91x+0.0124,R2=0.9994。式中:y為蘆丁吸光度,x為蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL);阿魏酸回歸方程:y=23.876x+0.0087,R2=0.9991。式中:y為阿魏酸吸光度,x為阿魏酸質(zhì)量濃度(mg/mL)。

圖1 蘆丁、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Rutin,ferulic acid standard curve

2.2 木賊乙醇提取物不同萃取部位總酚酸、總黃酮相對含量

木賊70%乙醇總提物及各部位萃取物中總黃酮及總酚酸相對含量差異很大(見圖2),乙酸乙酯萃取部位總黃酮與總酚酸相對含量最高,分別為(61.55±0.11)、(19.10±0.23) mg/g;石油醚相總黃酮相對含量最小,僅為(5.70±0.19) mg/g,水相中總酚酸相對含量最小,為(4.07±0.94) mg/g,實驗表明,乙酸乙酯從木賊乙醇提取物中富集的酚酸類和黃酮類成分含量最高,說明通過分步萃取,木賊醇提物中酚酸類和黃酮類成分得到初步分離純化。

圖2 木賊乙醇提取物不同萃取部位總黃酮、酚酸含量比較Fig.2 The total phenolic acid and flavonoid contents of the parts partitioned from the ethanol extraction from Equisetum hiemale L.

2.3 還原能力測定

由圖3 可知,以抗壞血酸為陽性對照,木賊70%乙醇提取物及各部位萃取物均有不同程度的還原能力,且在實驗濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系,隨著濃度的增加,還原能力呈上升趨勢。各部位還原能力由強到弱依次為:乙酸乙酯相>總提物>石油醚相>正丁醇相>水相。由此可見,還原能力與總黃酮和酚酸有關(guān),總提物的還原能力可能與較高含量的黃酮類成分有關(guān),石油醚相還原能力可能是該部位含有較強還原能力的某種化學(xué)成分,可能與酚酸類成分有關(guān)。相同濃度下,乙酸乙酯相還原能力明顯強于木賊醇提物中其他各相,當(dāng)濃度達到1.0 mg/mL時,清除率最高,為0.8065?？梢钥闯?還原能力強的活性成分集中分布在乙酸乙酯相,通過分段萃取可以獲得還原能力強于總提物的有效部位。

圖3 木賊乙醇提取物不同萃取部位還原能力(n=3)Fig.3 Reduction ability of different parts partitioned from the ethanol extraction from Equisetum hiemale L.(n=3)

2.4 對羥自由基(·OH)清除能力

由圖4和表1可知,以抗壞血酸為陽性對照,木賊醇提物及各部位萃取物對羥自由基(·OH)均表現(xiàn)出不同程度的清除作用,且呈一定的量效關(guān)系,隨樣品濃度的增加,清除能力增強。在實驗濃度范圍內(nèi),不同萃取部位對羥自由基(·OH)的清除能力隨濃度的變化存在差異,乙酸乙酯萃取部位對羥自由基(·OH)清除能力最強,IC50為(0.321±0.0026) mg/mL,總提物和正丁醇相對羥自由基(·OH)清除能力相當(dāng),IC50分別為(1.020±0.0134) mg/mL和(0.954±0.0067) mg/mL,石油醚相IC50為(1.704±0.0015) mg/mL,清除作用最弱。結(jié)合圖2推測,羥自由基(·OH)清除能力可能與各部位總黃酮含量相關(guān),乙酸乙酯相總黃酮遠高于其他各相。質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時,木賊乙酸乙酯相對羥自由基(·OH)的清除率為66.89%。高于總提物的54.37%,正丁醇相的50.92%,遠高于水相的47.75%和石油醚相的37.04%。進一步表明木賊清除羥自由基(·OH)活性成分集中分布在乙酸乙酯相。通過萃取可獲得活性較高抗氧化成分。

圖4 木賊乙醇提取物不同萃取部位對羥自由基清除能力(n=3)Fig.4 The removing ratio to hydroxyl radical of different parts partitioned from the ethanol extraction from Equisetum hiemale L.(n=3)

2.5 對ABTS+·的清除能力

由圖5和表1可知,在實驗濃度范圍內(nèi),木賊醇提物及各部位萃取物均有清除ABTS+·能力,且呈量效關(guān)系,清除能力隨樣品濃度增加而增大。木賊乙酸乙酯相對ABTS+·清除能力明顯高于其它各相,IC50為(0.213±0.0010) mg/mL,其次為總提物,水相清除能力最弱,IC50為(4.171±0.1099) mg/mL。結(jié)合圖2推測清除能力可能與各部位黃酮含量相關(guān),分析石油醚相與水相對ABTS+·清除率變化發(fā)現(xiàn),水相清除率變化較石油醚相緩慢,推測可能是石油醚相中含有對ABTS+·有清除能力的某種成分,可能由于此相中酚酸類成分有關(guān)。乙酸乙酯相對ABTS+·的清除率在濃度1.0 mg/mL時達到88.54%,表明通過分段萃取,可得到活性明顯高于總提物的有效部位。

圖5 木賊乙醇提取物不同萃取部位對ABTS+·清除能力(n=3)Fig.5 The removing ratio to ABTS of different parts partitioned from the ethanol extraction from Equisetum hiemale L.(n=3)

2.6 對DPPH·的清除能力

如圖6及表1所示,以抗壞血酸為陽性對照,木賊醇提物及各部位萃取物對DPPH·均有清除作用,在實驗濃度范圍內(nèi)清除能力隨樣品濃度增加而增大,呈一定的量效關(guān)系,不同極性部位對DPPH·的清除能力在相同濃度下存在差異。木賊乙酸乙酯相清除能力高于其余相,IC50為(0.169±0.0014) mg/mL,總提物與正丁醇相清除能力相對較弱,IC50分別為(0.352±0.0007) mg/mL和(0.460±0.0021) mg/mL,石油醚相清除能力最弱,IC50為(1.296±0.0064) mg/mL。結(jié)合圖2推測木賊醇提物及各部位萃取物對DPPH·的清除能力與黃酮類成分含量相關(guān)。當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時,木賊乙酸乙酯相的清除率為91.52%,石油醚相為47.40%。

圖6 木賊乙醇提取物不同萃取部位對DPPH·清除能力(n=3)Fig.6 The removing ratio to DPPH of different parts partitioned from the ethanol extraction from Equisetum hiemale L.(n=3)

表1 木賊乙醇提取物不同萃取部位對·OH自由基、 ABTS+·、DPPH·清除能力的比較Table 1 Comparison of the scavenging ability of ·OH radicals, ABTS+· and DPPH·of different parts partitioned from the ethanol extraction from Equisetum hiemale L.

2.7 木賊乙醇提取物不同萃取部位對·OH自由基、ABTS+·、DPPH·的半數(shù)清除率IC50

由表1中木賊乙醇提取物不同萃取部位對·OH自由基、ABTS+·、DPPH·的半數(shù)清除率IC50可知,抗氧化成分集中分布在了乙酸乙酯相。結(jié)合圖2各萃取相中黃酮與酚酸相對含量可以看出,黃酮是木賊抗氧化主要有效成分,通過系統(tǒng)萃取法萃取,木賊有效成分得到了富集,實現(xiàn)初步的分離。

3 結(jié)論

對木賊70%乙醇提取物及各部位萃取物中總黃酮及酚酸相對含量進行測定及體外抗氧化活性分析,結(jié)果表明木賊各部位總黃酮相對含量在5.70～61.55 mg/g之間,總酚酸相對含量在4.07～19.10 mg/g之間,并且對·OH自由基、ABTS+·及DPPH·均有一定的清除能力。其中,以乙酸乙酯相的總黃酮及總酚酸相對含量最高,對·OH自由基、ABTS+·及DPPH·的抗氧化活性也最強,而在ABTS+·的清除實驗中,石油醚相較水相有更強的清除能力,可能是該部位含有某種化學(xué)成分,對ABTS+·有一定的清除能力,以上結(jié)果提示黃酮可能是木賊主要抗氧化活性成分。酚酸可能有清除自由基作用,但抗氧化效果較黃酮差。

通過分段萃取,總提物中黃酮相對含量由13.45 mg/g提高到乙酸乙酯相萃取物中總黃酮的61.55 mg/g,總酚酸相對含量從總提物的4.67 mg/g提高到乙酸乙酯相的19.10 mg/g,實現(xiàn)了有效成分的富集。體外清除·OH自由基、ABTS+·及DPPH·的活性也由總提物的IC50分別為1.020、0.753、0.352 mg/mL降低到乙酸乙酯相的IC50分別為0.321、0.213、0.169 mg/mL。由此表明木賊抗氧化活性成分主要集中在乙酸乙酯相這種中等極性部位,因此,木賊乙酸乙酯萃取物可作為分離木賊抗氧化成分的重點研究部位,為進一步追蹤木賊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及木賊資源的開發(fā)提供可參考數(shù)據(jù)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典版(一部)[M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[2]樸惠順,金光洙.木賊的化學(xué)成分和藥理作用研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2006(6):1077-1078.

[3]嚴(yán)仲愷,李萬林.中國長白山藥用植物彩色圖志[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社,1997.

[4]李淑惠,靳丹虹,李德坤,等.木賊科植物研究概況Ⅰ.化學(xué)成分研究[J]. 中草藥,2000(7):92-94.

[5]周榮漢,于榮敏.木賊科植物化學(xué)成分研究概況[J]. 中藥通報,1985(3):5-9.

[6]楊波,苑艷光,張良.木賊中鎮(zhèn)痛成分的分離鑒定[J]. 佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1997,20(6):82.

[7]甄艷軍,牛麗穎,趙蘭英,等.木賊提取物對早期AS大鼠血管平滑肌凋亡及Fas、FasL表達的干預(yù)[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2007(1):45-47.

[8]易飛.木賊總黃酮的提取及活性研究[D]. 長春:吉林大學(xué),2014.

[9]劉勝利,黃少花,潘喜英,等.木賊提取液對老齡小鼠抗氧化作用的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志,2011,31(23):4620-4621.

[10]Revilla M C,Andrade Cetto A,Islas S,et al.Hypoglycemic effect of Equisetum myriochaetum aerial parts on type 2 diabetic patients[J]. J Ethnopharmacol,2002,81(1):117-20.

[11]Dos Santos Alves C F,Bonez P C,de Souza M E,et al.Antimicrobial,antitrypanosomal and antibiofilm activity ofEquisetumhyemale[J]. Microb Pathog,2016,101:119-125.

[12]張春梅.木賊乙酸乙酯提取物抗腫瘤活性成分研究[D]. 長春:延邊大學(xué),2012.

[13]姜秀娟,王旭輝,李奕,等.木賊正丁醇萃取物對高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮黏附分子表達的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志,2012,32(1):93-94.

[14]張鳳梅.木賊提取物對大鼠AS早期損傷的影響[D]. 石家莊:河北醫(yī)科大學(xué),2006.

[15]付影超,嚴(yán)銘銘,黃耀玲,等.節(jié)節(jié)草總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(10):1580-1583.

[16]劉勝利,黃少花,潘喜英,等.木賊提取液對老齡小鼠抗氧化作用的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志,2011,31(23):4620-4621.

[17]Sen S,Devanna N,Chakraborty R,et al.Total phenolic,total flavonoid content,and antioxidant capacity of the leaves ofMeynaspinosaRoxb.,an Indian medicinal plant[J]. Chin J Nat Med,2013,11(2):149-157.

[18]Vasquez C V,Rojas M G,Ramírez C A,et al.Total phenolic compounds in milk from different species. Design of an extraction technique for quantification using the Folin-Ciocalteu method[J].Food Chem,2015,176:480-486.

[19]Medina-Remón A,Barrionuevo-González A,Zamora-Ros R,et al.Rapid Folin-Ciocalteu method using microtiter 96-well plate cartridges for solid phase extraction to assess urinary total phenolic compounds,as a biomarker of total polyphenols intake[J]. Anal Chim Acta,2009,634(1):54-60.

[20]Karadirek,Kanmaz N,Balta Z,et al.Determination of total antioxidant capacity of humic acids using CUPRAC,Folin-Ciocalteu,noble metal nanoparticle-and solid-liquid extraction-based methods[J]. Talanta,2016,153:120-129.

[21]Hinojosa-Nogueira D,Muros J,Rufián-Henares JA,et al.New method to estimate total polyphenol excretion:Comparison of fast blue BB versus Folin-Ciocalteu performance in urine[J]. J Agric Food Chem,2017,65(20):4216-4222.

[22]Chen L Y,Cheng C W,Liang J Y.Effect of esterification condensation on the Folin-Ciocalteu method for the quantitative measurement of total phenols[J]. Food Chem,2015,170:10-15.

[23]Eom S J,Hwang J E,Jung J,et al.Short communication:Antioxidative and antibacterial activities on Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157∶H4 in milk with added ginseng marc extract fermented by Lactobacillus plantarum KCCM 11613P[J]. J Dairy Sci,2017,100(10):7788-7792.

[25]Ullah F,Iqbal N,Ayaz M,et al.DPPH,ABTS free radical scavenging,antibacterial and phytochemical evaluation of crude methanolic extract and subsequent fractions of Chenopodium botrys aerial parts[1][J]. Pak J Pharm Sci,2017,30(3):761-766.

[26]Valent I,Topolská D,Valachová K,et al.Kinetics of ABTS derived radical cation scavenging by bucillamine,cysteine,and glutathione. Catalytic effect of Cu2+ions[J]. Biophys Chem,2016,212:9-16.

[27]Kalili KM,De Smet S,van Hoeylandt T,et al.Comprehensive two-dimensional liquid to the ABTS radical scavenging assay:a powerful method for the analysis of phenolic antioxidants[J]. Anal Bioanal Chem,2014,406(17):4233-4242.