饒顯浪，鄧述愷（西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，四川瀘州646000）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，腺癌是其最主要的組織學(xué)類型，吉西他濱主要用于非小細胞肺癌一線化療及維持治療用藥。近年來，相關(guān)研究表明，谷氨酰胺具有一定的抗腫瘤作用，谷氨酰胺聯(lián)合化療可增強化療藥物對腫瘤細胞的作用。有研究表明，X?連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）在多種惡性腫瘤細胞中高表達，具有抑制腫瘤細胞凋亡、降低腫瘤細胞對化療藥物敏感性的作用[1]。本研究探討了體外谷氨酰胺聯(lián)合吉西他濱對人肺腺癌A549細胞增殖、凋亡及對XIAP表達的影響，旨在為肺癌化療提供更有效的方案及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肺腺癌A549細胞株為西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科贈送，吉西他濱購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司（批號：150804），谷氨酰胺、胚牛血清、胰酶、CCK?8試劑盒均購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司，達爾伯克孜良伊格爾哈姆F?12培養(yǎng)基（DMEM/F?12）購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，膜聯(lián)蛋白 V?異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V?FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自天津三箭生物技術(shù)有限公司，XIAP試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抑制濃度選取 吉西他濱濃度根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果及查閱文獻[1?2]得到人非小細胞肺癌的半數(shù)抑制濃度為0.01 mg/L，選取半數(shù)抑制濃度作為實驗濃度。谷氨酰胺濃度根據(jù)前期實驗結(jié)果選取最佳抑制濃度32 mmol/L為實驗濃度。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及分組 用含10%胚牛血清、100μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F?12培養(yǎng)液培養(yǎng)人肺腺癌A549細胞，置于含5%二氧化碳、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。設(shè)置空白對照組（無藥物干預(yù)）、吉西他濱組（0.01 mg/L）、谷氨酰胺組（32 mmol/L）、聯(lián)合用藥組[谷氨酰胺（32 mmol/L）聯(lián)合吉西他濱（0.01 mg/L）]，分別培養(yǎng) 24、48、72 h 進行實驗。

1.2.3 CCK?8法檢測細胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期的人肺腺癌A549細胞，按每孔1×104個細胞接種到96孔板，每孔加100 μL，貼壁后按實驗分組進行處理，分別加入吉西他濱（0.01 mg/L）、谷氨酰胺（32 mmol/L）及吉西他濱（0.01 mg/L）聯(lián)合谷氨酰胺（32 mmol/L）作用24、48、72 h，每組重復(fù) 5 孔，同時，設(shè)置對照組。各孔加入CCK?8試劑盒試劑0.01 mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值，實驗重復(fù)3次。按公式測定藥物對細胞的增殖抑制率。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 Annexin V?FITC/PI雙染后應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡。取對數(shù)生長期A549細胞按實驗分組進行干預(yù)，培養(yǎng)72 h后用胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min。用磷酸鹽緩沖液清洗2次后，用300 μL的結(jié)合緩沖液重懸。加入5 μL Annexin V?FITC，混勻后避光孵育 10 min，加入碘化丙啶 5 μL，混勻后避光孵育5 min，1 h內(nèi)采用流式細胞儀測定結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測A549細胞中XIAP的表達 取對數(shù)生長期A549細胞按實驗分組進行干預(yù)，培養(yǎng)72 h后收集上清液備用。設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔分別加入 0、25、50、100、200、400 pg/mL 標準品各50 μL；樣本孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL，空白孔不加。標準品孔和樣品孔中每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，封板后37℃孵育60 min，棄上清液，洗板 5 次；每孔加底物 A、B 各 50 μL，37℃避光孵育15 min，加入終止液50 μL，15 min內(nèi)在450 nm波長處測定各孔吸光度值。根據(jù)標準曲線計算XIAP終濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組組間、組內(nèi)比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組人肺腺癌A549細胞不同時間點增殖抑制率比較 谷氨酰胺組、吉西他濱組及聯(lián)合用藥組人肺腺癌A549細胞不同時間點增殖抑制率均明顯高于空白對照組，且隨作用時間的延長抑制作用逐漸增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組人肺腺癌A549細胞不同時間點增殖抑制率均明顯高于其他各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1、圖 1。

表1 各組人肺腺癌A549細胞不同時間點增殖抑制率比較（±s，%）

表1 各組人肺腺癌A549細胞不同時間點增殖抑制率比較（±s，%）

注：與空白對照組同時間點比較，aP＜0.05；與同組前一時間點比較，bP＜0.05；與谷氨酰胺組同時間點比較，cP＜0.05；與吉西他濱組同時間點比較，dP＜0.05

組別空白對照組吉西他濱組谷氨酰胺組聯(lián)合用藥組24 h 0.000±0.000 34.693±2.075a 28.773±0.468a 54.690±1.510acd 48 h 0.000±0.000 51.806±1.018ab 48.803±0.801ab 71.780±0.318abcd 72 h 0.000±0.000 69.961±0.697ab 66.888±0.376ab 79.664±0.749abcd

圖1 不同時間點對人肺腺癌A549細胞增殖抑制率的影響

2.2 各組人肺腺癌A549細胞作用72 h后凋亡率比較空白對照組人肺腺癌A549細胞作用72 h后凋亡率為（2.9±0.8）%，吉西他濱組為（53.6±2.0）%，谷氨酰胺組為（37.6±1.7）%，聯(lián)合用藥組為（60.0±0.4）%。與空白對照組比較，吉西他濱組、谷氨酰胺組、聯(lián)合用藥組人肺腺癌A549細胞作用72 h后凋亡率均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組人肺腺癌A549細胞作用72 h后凋亡率明顯高于吉西他濱組、谷氨酰胺組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 2、3。

圖2 各組人肺腺癌A549細胞作用72 h后凋亡率比較

圖3 各組人肺腺癌A549細胞作用72 h后細胞凋亡圖

2.3 各組人肺腺癌A549細胞XIAP表達比較 空白對照組人肺腺癌A549細胞XIAP表達水平為（217.131±7.105）pg/mL，吉西他濱組為（276.972±10.505）pg/mL，谷氨酰胺組為（116.267±8.268）pg/mL，聯(lián)合用藥組為（163.448±5.517）pg/mL。與空白對照組比較，吉西他濱組人肺腺癌A549細胞XIAP表達明顯升高，谷氨酰胺組、聯(lián)合用藥組人肺腺癌A549細胞XIAP表達均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組人肺腺癌A549細胞XIAP表達比較

3 討 論

肺癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均居癌癥首位，尤以非小細胞肺癌居多，其中腺癌是肺癌最主要的組織學(xué)類型。目前，化療仍是肺癌的主要治療方法之一。

吉西他濱屬細胞周期特異性抗代謝藥物，主要作用于DNA合成期，其特點為抗瘤譜廣、不良反應(yīng)少，1996年美國食品藥品監(jiān)督管理局正式批準吉西他濱作為非小細胞肺癌的一線化療藥物[3]。但目前肺癌對吉西他濱存在一定普遍耐藥情況，其臨床應(yīng)用受到一定限制。吉西他濱在體內(nèi)代謝過程復(fù)雜，涉及多種蛋白和因子的參與，其耐藥性的產(chǎn)生也是由多因素共同作用的結(jié)果[4]。因此，尋找有效的藥物增強非小細胞肺癌對吉西他濱的敏感性及增強化療療效尤為重要。

谷氨酰胺是一種條件必需氨基酸，是包括腫瘤細胞在內(nèi)的快速生長細胞的主要能源物質(zhì)。但近年來不少研究表明，谷氨酰胺具有一定的抗腫瘤作用。MAR?TINS等[5]發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠補充谷氨酰胺可抑制腫瘤細胞生長，減輕惡病質(zhì)，在FRACARO等[6]的研究中也得到證實。有研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺導(dǎo)管腺癌細胞中補充谷氨酰胺可抑制腫瘤細胞生長[7]。TODOROVA等[8]發(fā)現(xiàn)，荷瘤動物經(jīng)腸補充谷氨酰胺可誘導(dǎo)細胞凋亡，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺可下調(diào)β細胞淋巴瘤/白血病基因?2表達水平，同時，上調(diào)β細胞淋巴瘤/白血病基因?2相關(guān)蛋白 X、凋亡蛋白酶?3（Caspase?3）表達水平，從而抑制腫瘤細胞增殖。

本研究結(jié)果顯示，谷氨酰胺組人肺腺癌A549細胞增殖抑制率明顯高于空白對照組，且隨作用時間的延長抑制作用也增強；谷氨酰胺組人肺腺癌A549細胞凋亡率也明顯高于空白對照組，提示谷氨酰胺能抑制A549細胞增殖，促進A549細胞凋亡。

XIAP是IAPs的成員之一，是凋亡抑制蛋白家族中唯一能直接抑制凋亡蛋白酶的凋亡抑制蛋白，能同時抑制起始階段及效應(yīng)階段的凋亡蛋白酶，通過抑制啟動性Caspase?9在上游阻止Caspase?3的激活，通過抑制效應(yīng)性Caspase?3和Caspase?7而阻止凋亡通路下游途徑，對凋亡蛋白酶誘發(fā)的外源性及內(nèi)源性細胞凋亡過程具有明顯的抑制作用，是作用極強的凋亡抑制劑[9?10]。XIAP在許多腫瘤中高表達，包括非小細胞肺癌，且腫瘤的病理分期越晚，組織學(xué)分化越差，術(shù)后復(fù)發(fā)率越高，XIAP 表達量越高[11?12]。XIAP 參與了化療耐藥，相關(guān)的體內(nèi)、外實驗結(jié)果顯示，下調(diào)XIAP表達能增加腫瘤細胞對化療誘導(dǎo)凋亡的敏感性[13]。

近年來，不少研究報道了吉西他濱能上調(diào)胰腺癌中XIAP的表達，導(dǎo)致腫瘤細胞對吉西他濱的敏感性降低[14?15]。因此，作者猜想，吉西他濱能上調(diào)肺癌XIAP的表達，谷氨酰胺能下調(diào)XIAP的表達。本研究結(jié)果顯示，吉西他濱能上調(diào)XIAP的表達，谷氨酰胺、吉西他濱聯(lián)合谷氨酰胺均能降低XIAP的表達，且聯(lián)合用藥組人肺腺癌A549細胞增殖抑制率及細胞凋亡率均高于吉西他濱組和谷氨酰胺組，表明谷氨酰胺能增強吉西他濱的抗腫瘤作用。

綜上所述，谷氨酰胺能抑制人肺腺癌A549細胞增殖，促進凋亡，聯(lián)用吉西他濱時能明顯增強吉西他濱對

人肺腺癌細胞的抑制作用，可能與通過下調(diào)XIAP表達從而增強肺癌細胞對吉西他濱的敏感性有關(guān)，但其具體機制尚有待于進一步研究。

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