夏 昕，周海健，湛志飛，覃 迪，賀子翔, 蔡 亮，高立冬，戴德芳

(1湖南省疾病預(yù)防控制中心, 湖南 長沙 410005；2 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室,北京 102206)

流行性腦脊髓膜炎(簡稱流腦)是由腦膜炎奈瑟菌引起的國家法定乙類傳染病之一，盡管隨著A+C群流腦疫苗的普及，流腦的發(fā)病率呈逐年下降趨勢，但由于腦膜炎奈瑟菌菌株在疫苗的選擇性壓力下可導(dǎo)致人群中存在菌群和毒力的變遷，一旦發(fā)生血清群的轉(zhuǎn)換，則又可能引起新的大流行，切不可放松警惕。在解放后全國A群流腦大流行的背景下，我省也發(fā)生過數(shù)次A群流腦的大流行，但自2006年后，便再未報道過A群流腦病例，甚至健康人群的帶菌調(diào)查中，也未再發(fā)現(xiàn)A群流腦菌株的蹤跡。健康人群帶菌，近年來以一般不致病的不可分群流腦和偶可致病的B群流腦菌株多見，B群流腦多為散發(fā)，經(jīng)試驗后發(fā)現(xiàn)分子分型型別多樣化，未見優(yōu)勢菌群[1]；但是，B群流腦因其莢膜不穩(wěn)定而無有效的多糖疫苗，基于外膜蛋白核酸的疫苗，尚在積極的研發(fā)中[2]，隨著現(xiàn)有流腦疫苗的普及應(yīng)用，我省腦膜炎奈瑟菌的菌群也在悄然發(fā)生變遷，我省自2006年末首次報道發(fā)現(xiàn)C群流腦病例[3]，2012年首次報道發(fā)現(xiàn)W135群流腦病例后[4]，C群和W135群病例所占的比例有所上升，且近年來，從密切接觸者和健康人群監(jiān)測中，均分離到不少C群和W135群菌株。因此，現(xiàn)將我省近幾年來從患者、患者密切接觸者以及健康人群帶菌調(diào)查中收集到的部分C群和W135群流腦菌株，對其進(jìn)行藥敏及脈沖腸凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)分型以及多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)，以探討其病原學(xué)遺傳特性以及流行病學(xué)的相關(guān)性，其結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 資料及菌株來源 資料來源于《湖南省疫情資料匯編》和中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)報告。菌株分離于2006—2016年湖南省內(nèi)流腦患者、患者密切接觸者以及健康人群帶菌調(diào)查的標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 生化和血清學(xué)鑒定 將上送的疑似腦膜炎奈瑟菌菌株接種到巧克力平板上，置5% CO2，37℃溫箱培養(yǎng)24 h后，再挑取單個菌落做進(jìn)一步的分純培養(yǎng)，然后取新鮮純培養(yǎng)物按說明書接種到生物梅里埃公司的API NH生化鑒定試紙條上，37℃繼續(xù)孵育2.0～2.5 h，根據(jù)培養(yǎng)后的顏色變化記錄生化結(jié)果，并根據(jù)編碼讀取鑒定結(jié)果。生化確認(rèn)后，再將菌落用Remel Europe Ltd的腦膜炎奈瑟菌診斷血清做進(jìn)一步的血清學(xué)分型，先用流腦多價血清進(jìn)行凝集，再用因子血清分群，并記錄結(jié)果，做血清凝集的同時用生理鹽水做對照。

1.2.2 藥敏試驗 參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI，2013版)推薦的指南，按照我國腦膜炎奈瑟菌監(jiān)測方案推薦的12種抗菌藥物，對青霉素和氨芐西林采用E-test試紙條法，其余10種抗菌藥物采用K-B紙片法進(jìn)行藥敏試驗，將腦膜炎奈瑟菌用生理鹽水調(diào)節(jié)濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝缓?，均勻涂布?%的脫纖維羊血MH瓊脂，再將K-B藥敏紙片或E-test藥敏試紙條貼于血MH瓊脂表面，靜置片刻后，置5%CO2，37℃溫箱培養(yǎng)18～24 h讀取結(jié)果，最后根據(jù)CLSI的標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果為敏感、中介或者耐藥。藥敏質(zhì)控菌株：肺炎鏈球菌ATCC 49619以及PFGE Marker沙門菌H9812，為湖南省疾病預(yù)防控制中心微生物實驗室留存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PFGE分型 根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心 PulseNet China網(wǎng)中心實驗室發(fā)布的腦膜炎奈瑟菌脈沖場凝膠電泳(PFGE)標(biāo)準(zhǔn)操作方案(SOP)進(jìn)行試驗(http://www.pulsenet-china.net/)。將菌株用巧克力平板置5% CO2，37℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，挑取菌落純培養(yǎng)物均勻懸浮于CSB緩沖液中，用1%SeaKem Gold制備上樣小膠塊，用蛋白酶K裂解再洗滌后，腦膜炎奈瑟菌用Nhe I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，Marker H9812標(biāo)準(zhǔn)菌株用Xba I限制性內(nèi)切酶酶切，37℃溫浴約3 h，再根據(jù)操作方案設(shè)置參數(shù)和條件，電泳16 h。起始脈沖時間：l s；終止脈沖時間：25 s；電壓：6 V/cm；電泳溫度：14℃，電泳完畢后用Gelred核酸染料染色約25 min，最后用凝膠成像儀讀取tif圖像。獲得圖譜后，再使用BioNumerics軟件處理，聚類樹形圖類型選擇UPGMA(unweighted pair group method with averages)方法，不同帶型的電泳條帶的相似性采用Dice相關(guān)系數(shù)百分比表示。

1.2.4 MLST 參考PubMLST(http://pubmlst.org/neisseria)網(wǎng)站的標(biāo)準(zhǔn)方案，分析腦膜炎奈瑟菌的7個管家基因，即abcZ(ABC轉(zhuǎn)運子)、adk(腺苷酸激酶)、aroE(莽草酸脫氫酶)、fumC(延胡索酸酶)、gdh(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、pdhC(丙酮酸脫氫酶亞單位)、pgm(磷酸葡萄糖變位酶)，對管家基因及引物進(jìn)行PCR擴增：50 μL反應(yīng)體系，引物1 μmol/L終濃度，dNTP 200 μmol/L，Taq酶2.5 U，模板1 μL，反應(yīng)條件為94℃ 2 min；94℃ 1 min、56℃ 1 min、72℃ 2 min 共29個循環(huán)；72℃ 2 min 結(jié)束，再對擴增后的產(chǎn)物分別進(jìn)行測序，測序結(jié)果與PubMLST數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/neisseria)進(jìn)行檢索比對，獲得各管家基因位點的等位基因數(shù)值，并確定其序列型(ST)，MLST試驗的PCR擴增引物序列見表1，MLST試驗的測序引物序列見表2。

表1腦膜炎奈瑟菌MLST分型PCR擴增引物序列

Table1MLST and PCR amplification primer sequences ofNeisseriameningitidis

引物名稱引物序列5’?3’產(chǎn)物大小(bp)abcZ?P1CTGTTCCGCTTCGACTGCCAAC900abcZ?P2CTCCCCGTCGTAAAAAACAATCadk?P1BCCAAGCCGTGTAGAATCGTAAACC730adk?P2BTGCCCAATGCGCCCAATACaroE?P1BTTTGAAACAGGCGGTTGCGG780aroE?P2BCAGCGGTAATCCAGTGCGACfumC?P1BTCCCCGCCGTAAAAGCCCTG800fumC?P2BGCCCGTCAGCAAGCCCAACgdh?P1BCTGCCCCCGGGGTTTTCATCT680gdh?P2BTGTTGCGCGTTATTTCAAAGAAGGpdhC?P1BCCGGCCGTACGACGCTGAAC720pdhC?P2BGATGTCGGAATGGGGCAAACApgm?P1CTTCAAAGCCTACGACATCCG1200pgm?P2CGGATTGCTTTCGATGACGGC

表2腦膜炎奈瑟菌MLST分型測序引物序列

Table2Primer sequences for MLST sequencing ofNeisseriameningitidis

引物名稱引物序列5’?3’產(chǎn)物大小(bp)abcZ?S1AAATCGTTTATGTACCGCAGR433abcZ?S2GAGAACGAGCCGGGATAGGAadk?S1AAGGCWGGCACGCCCTTGG465adk?S2CAATACTTCGGCTTTCACGGaroE?S1AGCGGTCAAYACGCTGRTK490aroE?S2ATGATGTTGCCGTACACATAfumC?S1TCCGGCTTGCCGTTTGTCAG465fumC?S2TTGTAGGCGGTTTTGGCGACgdh?S3CCTTGGCAAAGAAAGCCTGC501gdh?S4CRCGCACGGATTCATRYGGpdhC?S1TCTACTACATCACCCTGATG480pdhC?S2ATCGGCTTTGATGCCGTATTTpgm?S1CGGCGATGCCGACCGCTTGG450pgm?S2AGGTGATGATTTCGGTYGCRCC

2 結(jié)果

2.1 一般資料 2006—2016年，湖南省共報告實驗室診斷病例21例，通過對分離腦膜炎奈瑟菌的血清學(xué)分群后確認(rèn)為C群11株、B群6株、W135群4株。從已報告的流腦實驗室確診病例密切接觸者以及三個省級流腦監(jiān)測點中共培養(yǎng)分離出腦膜炎奈瑟菌114株，其中B群55株、C群19株、W135群5株、不可分群35株。

2.2 菌株鑒定與選取結(jié)果 從2006—2016年間湖南省內(nèi)流腦患者、患者密切接觸者以及健康人群帶菌調(diào)查標(biāo)本中分離的腦膜炎奈瑟菌，再次經(jīng)API NH生化鑒定卡以及多價血清及群因子血清凝集試驗確認(rèn)后，選取其中22株C群、9株W135群腦膜炎奈瑟菌為本次研究菌株。22株C群腦膜炎奈瑟菌中，來自于患者的血6株、腦脊液1株，患者密切接觸者的咽拭子10株，健康帶菌者咽拭子5株；9株來自于張家界市，7株來自衡陽市，3株來自于湘潭市，長沙市、株洲市、郴州市各1株。9株W135群腦膜炎奈瑟菌中，來自于患者的血3株、腦脊液1株，患者密切接觸者的咽拭子3株，健康帶菌者咽拭子2株；3株來自于長沙市，張家界市、衡陽市各2株，株洲市、益陽市各1株。

2.4 PFGE分型結(jié)果 22株C群腦膜炎奈瑟菌經(jīng)PFGE分型后，以70%相似度為標(biāo)準(zhǔn)，共分為2個簇、5種PFGE帶型；按相似度≥90%為同一亞型，其中18株HNC-01和HNC-02菌株屬于同一亞型。2006年湖南的第1例C群患者分離的菌株P(guān)FGE帶型為HNC-02，與2012、2013年患者以及患者密切接觸者分離菌株的圖譜完全一致，與帶型為HNC-01的2008、2010、2013年患者分離的菌株僅有一個帶型的差異，均屬于優(yōu)勢帶型， 另2008年分離菌株中有1例患者與1名健康帶菌者帶型一致，為帶型HNC-05。見圖1。9株W135群腦膜炎奈瑟菌經(jīng)PFGE分型后共分為2個帶型，其中首例患者與2013、2016年患者分離的菌株帶型一致，均為HNW-01型，帶型HNW-02的2株W135群流腦菌株分離自2012年1例C群死亡患者的密切接觸者[5]，與患者血清型不一致，為正常人群攜帶的非流行株。見圖2。

表331株腦膜炎奈瑟菌對12種抗菌藥物的藥敏結(jié)果(%)

Table3Antimicrobial susceptibility testing results of 31Neisseriameningitidisstrains to 12 kinds of antimicrobial agents(%)

抗菌藥物C群腦膜炎奈瑟菌(n=22)敏感中介耐藥W135群腦膜炎奈瑟菌(n=9)敏感中介耐藥青霉素90．919．090．00100．000．000．00氨芐西林100．000．000．00100．000．000．00頭孢噻肟100．000．000．00100．000．000．00頭孢曲松100．000．000．00100．000．000．00美羅培南100．000．000．00100．000．000．00米諾環(huán)素100．000．000．00100．000．000．00氯霉素100．000．000．00100．000．000．00阿奇霉素100．000．000．00100．000．000．00左氧氟沙星27．2722．7350．0055．5622．2222．22環(huán)丙沙星40．9136．3622．7377．780．0022．22利福平100．000．000．00100．000．000．00復(fù)方磺胺甲口惡唑0．000．00100．0033．3311．1155．56

2.5 MLST結(jié)果 選取C群的優(yōu)勢帶型HNC-01、HNC-02和W135群的優(yōu)勢帶型HNW-01的部分菌株，進(jìn)行MLST，擴增產(chǎn)物均在700-1 400 bp之間。產(chǎn)物純化后，經(jīng)DNA雙通道序列測定，將不同的等位基因序列提交至MLST數(shù)據(jù)庫，經(jīng)PubMLST檢索比對，結(jié)果顯示，測序后的7個基因位點的等位基因數(shù)值相對應(yīng)的等位基因譜C群HNC-01、HNC-02帶型菌株均為ST4821型，W135群HNW-01帶型為ST11型。

圖1 22株C群腦膜炎奈瑟菌PFGE分型軟件分析結(jié)果

圖2 9株W135群腦膜炎奈瑟菌PFGE分型軟件分析結(jié)果

3 討論

流行性腦脊髓膜炎是一種在我國流傳的既古老又新鮮的傳染病，發(fā)病歷史悠久，但菌群仍在持續(xù)發(fā)生變遷，一旦感染，兒童極易引發(fā)暴發(fā)型流腦，如不及時治療，6～24 h內(nèi)即可危及生命，病情兇險，病死率高，切不可掉以輕心。據(jù)《湖南省疫情資料匯編》和中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)報告，湖南省在1951—2016年間，共報告流腦病例504 498例，死亡48 305例，發(fā)病率波動于0.003/10萬～34.08/10萬之間，并于1959、1967年以及1974—1977年期間出現(xiàn)3次流行高峰。自二十世紀(jì)八十年代流腦A群多糖疫苗廣泛使用后，發(fā)病率逐年大幅下降，全省范圍內(nèi)未再出現(xiàn)暴發(fā)流行，流行周期已不明顯。2007年6月，我省將A+C群流腦疫苗納入免疫規(guī)劃，并實施擴大國家免疫規(guī)劃，流腦疫情得到有效控制。近10年(2007—2016年)流腦發(fā)病率波動于0.003/10萬～0.035/10萬之間，徘徊在歷史低位，2014、2016年全省僅各報告病例2例。病例以15歲以下年齡段人群為主，主要分布在湖南的西部和中南部，2004—2016年數(shù)據(jù)顯示，發(fā)病率居前五位的市州為：湘西自治州、張家界市、湘潭市、長沙市、益陽市，占全省病例的57.14%[6]。

由于A群多糖疫苗多年來的普及，我省A群腦膜炎奈瑟菌已逐漸消退。自2006年我省衡陽地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)C群流腦病例以來，其后幾年病例以C群流腦流行為主。隨著A+C流腦疫苗免費接種步伐的推進(jìn)，2012年我省又首次發(fā)現(xiàn)了W135群流腦病例，隨后W135群病例開始逐漸增多。B群流腦疫苗由于莢膜的多變性，疫苗尚在研制和驗證階段，需要多劑次及佐劑的配合，方能產(chǎn)生保護(hù)性抗體[7]。我省在健康人群監(jiān)測中B群流腦多見，型別多樣，個別型別可致病，但癥狀較C群和W135群流腦輕。本次研究主要分析了我省近年來的C群和W135群腦膜炎奈瑟菌的病原學(xué)特征，以探討其流行病學(xué)特征。

22株C群腦膜炎奈瑟菌和9株W135群腦膜炎奈瑟菌，均來自于患者、密切接觸者以及健康人群帶菌調(diào)查中分離到的菌株，C群菌株的時間跨度為2006—2016年；W135群菌株的時間跨度為2012—2016年，患者以長株潭、衡陽及張家界為主，病例既有兒童、學(xué)生，也有成人，發(fā)病時間集中在歷年的10月到次年6月間，夏季沒有病例。我省自2014年開始，鮮有檢出C群病例，新發(fā)的W135群病例開始逐步增多。有研究[8]認(rèn)為，W135群腦膜炎奈瑟菌與我國早年曾引起多次大流行的A群菌株表達(dá)相同的菌毛結(jié)構(gòu)蛋白PilE和主要黏附蛋白NadA，提示W(wǎng)135群腦膜炎奈瑟菌可能具有與A群腦膜炎奈瑟菌相似的傳播流行模式，以往A群的流行常引起聚集性和暴發(fā)，故對W135群菌株可能造成的流行應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度。

對C群和W135群腦膜炎奈瑟菌分別進(jìn)行PFGE分型分析比較，發(fā)現(xiàn)22株C群腦膜炎奈瑟菌共分為5個帶型，其中優(yōu)勢帶型HNC-01和帶型HNC-02的18株菌的帶型兩者間僅有一個條帶的差異，相似度在95%以上，根據(jù)Tenover[10]研究原則，認(rèn)為這些差異可能是菌株偶發(fā)的一次基因事件引起的帶型變化，這種情況?？砂l(fā)生在菌株重復(fù)培養(yǎng)或同一患者多次分離時發(fā)生，故可以認(rèn)為其在遺傳角度是有高度同源性的，在流行病學(xué)上也是緊密相關(guān)的。帶型HNC-03和帶型HNC-04分別來自于健康人群的攜帶菌，與優(yōu)勢菌群按70%相似度為標(biāo)準(zhǔn)，仍然歸為同一簇。帶型HNC-05的2株菌與其余20株菌，從遺傳角度來說，相差較遠(yuǎn)，分別來自于2008同一年的患者及健康帶菌調(diào)查，時間上有差異，地點也不一樣，但既然能夠引起病例的發(fā)生，就可能為另一種C群的潛在流行群，應(yīng)引起重視。9株W135群腦膜炎奈瑟菌經(jīng)過PFGE電泳后共分為2種帶型，優(yōu)勢帶型HNW-01的7株菌株分離自2012—2016年間的患者、密切接觸者及帶菌者，其PFGE圖譜完全一致，帶型HNW-02為2012年4月一起C群流腦死亡患者的密切接觸者調(diào)查中分離到的2株W135群腦膜炎奈瑟菌，當(dāng)年那起流行事件中的“主角”是C群腦膜炎奈瑟菌，這2株W135群菌株只是偶然分離到，并未引起密切接觸者發(fā)病，PFGE分型顯示，其與致病的優(yōu)勢流行克隆群帶型并不相同，相似度低于90%，是否可能致病，還有待進(jìn)一步研究。值得引起注意的是，我省報道的C群和W135群首例病例分離菌株，帶型與優(yōu)勢帶型一致，可以認(rèn)為自首例病例后，即開始了該型別菌株的流行。

目前，全球流腦病例主要由7個高致病性Nm序列群的菌株引起，分別是ST1序列群、ST5序列群、ST8序列群、ST11序列群、ST32序列群、ST41/44序列群以及ST4821序列群。湖南省的C群流腦優(yōu)勢流行菌株進(jìn)行了MLST后，結(jié)果均為ST4821群，屬于我國特有的主要流行克隆群[11]。湖南省W135群流腦優(yōu)勢流行菌株的型別，通過MLST后，為高致病性的ST11群，與目前全球主要流行的侵襲性W135群腦膜炎奈瑟菌的ST型別一致[9, 12-13]，也與目前我國其他省市的新發(fā)W135群的型別一致[14]。

從病例菌群的統(tǒng)計結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，自2006年我省第一次發(fā)現(xiàn)C群流腦病例以來，就再未檢出過A群病例。從2006—2013年，幾乎每年都可以檢出C群病例，說明C群已經(jīng)取代了A群，成為我省的優(yōu)勢菌株，但自從2012年我省首次發(fā)現(xiàn)W135群流腦病例以來，C群流腦病例便呈現(xiàn)下降趨勢。2014—2016年未報道C群流腦病例，而W135群菌株已經(jīng)通過健康人群監(jiān)測進(jìn)入了我們的視野，同時也引起了相關(guān)的流腦疾病。B群流腦病例由于暫時無疫苗可預(yù)防，一直時有發(fā)生，說明我省的流腦流行菌群正在向多元化發(fā)展，這與我國將A+C群多糖疫苗納入免疫規(guī)劃的政策息息相關(guān)。在疫苗的選擇性壓力下，流腦菌群的悄然變遷也給我們的防控工作帶來更大挑戰(zhàn)，在我國流腦的局部暴發(fā)仍不斷出現(xiàn)。在非洲仍有周期性的流腦大流行，如果不控制這種流行趨勢，可能會殃及其他洲[15]。

鑒于我省W135群流腦病例自2012年后時有發(fā)生，且存在優(yōu)勢流行克隆群的條件下，應(yīng)大力宣傳和推廣有效的疫苗免疫策略，國際市場上的腦膜炎球菌多糖疫苗(MPV)有2價(A+C群)和4價(A、C、Y、W135群)兩種，是由相應(yīng)血清群Nm制成純化的、對熱穩(wěn)定的凍干的莢膜多糖，疫苗具有良好的安全性和免疫原性[16]，可將C群和W135群流腦造成的隱患進(jìn)一步控制。新的防控策略制定和實施后，也不能放松對流腦病原學(xué)的監(jiān)測，由于該菌群存在著一個血清群的變遷，積極的主動監(jiān)測能為我省流腦的防控起到有效的預(yù)測預(yù)警作用。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步加強實驗室的檢測能力，密切關(guān)注我省流腦流行菌群的變遷趨勢，并制定相應(yīng)對策，將這一古老又新鮮的傳染病始終控制在低發(fā)病水平。

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