高紅亮，吳 超，王 超，程 倩，李 曙

(皖南醫(yī)學院 病理生理學教研室，安徽 蕪湖 241002 )

氧化應激是指機體在遭受到有害刺激后，機體細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生過多，導致組織和細胞的損傷[1]。由于氧化應激的增強，組織細胞內ROS水平急劇上升，而抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)等活性降低，使得ROS大量生成積聚，損傷核酸、蛋白質及脂質，導致炎癥因子表達，并觸發(fā)包括平滑肌細胞增殖和遷移在內的多種病理反應，甚至引起細胞凋亡或壞死[2-5]。氧化應激與臨床上多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著極大的聯(lián)系，如動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展、肺纖維化、癲癇、高血壓等[6]。沙利度胺(反應停又名酞胺哌啶酮，Thalidomide)最初作為鎮(zhèn)靜劑治療妊娠嘔吐,因有致畸作用(嬰兒海豹肢)而被禁用。隨著近年來的研究，沙利度胺作為抗血管生成劑和免疫調節(jié)劑被用于多種疾病的治療[7]，但是在對抗炎癥引起的氧化應激損傷中的研究較少，本實驗旨在通過體外炎癥氧化應激模型的構建，觀察沙利度胺對其的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 沙利度胺購于常州制藥廠，為純品原料藥，將其溶解于二甲基亞砜(DMSO)后得終濃度為50 g/L的母液。四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購于碧云天生物有限公司，脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)(貨號L2880，Sigma公司),凋亡試劑盒(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)獲于弋磯山醫(yī)院中心實驗室。用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)基中加入雙抗(1%青霉素和鏈霉素)共同培養(yǎng)。

1.2.2 MTT實驗 MTT法檢測沙利度胺對于HUVEC的無毒性濃度范圍。消化培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的HUVEC，接種在96孔培養(yǎng)板中，保證細胞密度為1×104/孔，次日待貼壁后，換液，加入沙利度胺終濃度分別為1000、500、250、62、31 mg/L的無血清培養(yǎng)基，每個濃度設3個副孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入MTT( 5g/L) 各20 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，吸出培養(yǎng)液，將DMSO 150 μL分別加入每孔，搖床上避光輕微振蕩5 min使結晶紫充分溶解，在酶標儀570 nm 波長下測吸光度(C)值。

1.2.3 流式細胞術檢測最佳造模濃度及時間 LPS濃度設為4組(0.125、0.25、0.5、1 mg/L)，分別處理HUVEC 6、12、24 h后PBS洗2遍，收集細胞上清液離心，接著采用0.25%不含EDTA的胰酶消化，制備濃度為1×106個細胞 /mL的單細胞懸液，2000 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，收集細胞，用200 μL緩沖液重懸，分別加入5 μL FITC和10 μL PI，4℃避光孵育15 min。用PBS將懸液補充至700 μL，上機檢測。采用流式細胞術檢測LPS不同濃度及時間點的凋亡率。

1.2.4 流式細胞術檢測沙利度胺最佳預處理時間 分別用沙利度胺無細胞毒性的最大濃度預處理HUVEC 6、12、24 h后直接加入LPS處理，采用流式細胞術檢測沙利度胺不同預處理時間的凋亡率。

2 結果

2.1 LPS最佳作用時間及濃度的確定 通過流式細胞術測定LPS最佳作用時間及濃度，結果顯示，較低濃度的LPS(0.25 mg/L,圖1A)即可引起HUVEC的凋亡，且隨著時間的延長，凋亡率逐漸增加(圖1B、C、D)。處理6 h后我們發(fā)現(xiàn)不同濃度組凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(F=24.12,P=0.00)，通過兩兩比較，1 mg/L和2 mg/L LPS組與0.25 mg/L、0.5 mg/L LPS組相比，凋亡率升高(P<0.05)，而1 mg/L和2 mg/L LPS組凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。在處理12 h時，單因素方差分析不同濃度組凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(F=56.34,P=0.00)，SNK法兩兩比較我們發(fā)現(xiàn)2 mg/L LPS的凋亡率最高(P<0.05)，可以達到80%，但還是不能達到模型的要求。通過對處理24 h后不同濃度組凋亡率的方差分析(F=42.18,P=0.00)，差異有統(tǒng)計學意義后進行兩兩比較，1 mg/L LPS處理后24 h的凋亡率和2 mg/L LPS處理24 h后的凋亡率都可以達到92%左右(圖1E)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。故最終我們選取造模條件為1 mg/L LPS處理24 h。

A～D：0.25、0.5、1、2 mg/L LPS分別作用6、12、24 h；E：不同濃度沙利度胺分別處理6、12、24 h的調亡率比較。

圖1 流式細胞術測定LPS最佳作用時間及濃度

3.2 沙利度胺無細胞毒性濃度范圍的確定 通過MTT法測定沙利度胺的無細胞毒性范圍，結果顯示，當沙利度胺濃度為31、62、125 mg/L時對細胞基本是無毒性作用的(P>0.05，vs. Control)，故最終確定沙利度胺無細胞毒性濃度范圍為0～100 mg/L。見圖2。

圖2 不同濃度沙利度胺對HUVEC活力的影響

3.3 沙利度胺最佳干預時間的確定 通過流式細胞術測定100 mg/L沙利度胺最佳預處理時間，方差分析不同干預組凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(F=13.12,P=0.00)，兩兩比較結果顯示，與模型組凋亡率(91.6%)相比，沙利度胺預處理6 h(43.26%)、12 h(44.29%)、24 h(43.71%)的凋亡率均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但是沙利度胺預處理組各之間凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。故確定用沙利度胺預處理6 h。見圖3。

3.4 不同濃度沙利度胺保護作用的比較 通過流式細胞術測定不同濃度沙利度胺對氧化應激的保護作用。方差分析不同濃度組凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(F=52.12,P=0.00)，兩兩比較結果顯示，與模型組凋亡率(75.74%)相比，沙利度胺1 mg/L(68.62%)，10 mg/L(52.66%)，100 mg/L(23.04%)預處理組均表現(xiàn)出了不同程度的保護作用，其中100 mg/L沙利度胺預處理組凋亡率與1 mg/L，10 mg/L預處理組相比，凋亡率下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

1：空白對照組；2：模型組；3：沙利度胺單獨作用組；4～6：100 mg/L沙利度胺預處理6、12、24 h后LPS作用24 h。

圖3 沙利度胺預處理不同時間點對HUVEC凋亡率的影響

1：空白對照組；2：模型組；3～5：1、10、100 mg/L沙利度胺預處理6 h后LPS作用24 h。

圖4 不同濃度沙利度胺保護作用的比較

4 討論

在很多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，氧化應激損傷都參與了其中的反應。血管內皮細胞在維持血管內環(huán)境穩(wěn)定中起到重要的屏障作用，但是由于氧化應激反應的發(fā)生，首先受到損傷的便是內皮細胞，而氧化應激反應所產生的ROS是導致血管內皮細胞凋亡的主要因素[8-11]。而心血管疾病發(fā)生與發(fā)展的最主要原因便是炎癥。有研究表明，動脈粥樣硬化斑塊的形成與凋亡的內皮細胞存在著很大的聯(lián)系。故通過體外構建炎癥模型來探討炎癥發(fā)生時內皮細胞的保護方法顯得尤為重要。LPS是革蘭陰性細菌外璧層中特有的一種化學成分，能夠刺激體內多種細胞合成和釋放眾多內源性生物活性因子,導致全身性炎癥反應發(fā)生,由此引起中毒性休克、全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征[12-13]，用于多種體外炎癥模型的構建。而由于近年來沙利度胺在臨床上的廣泛應用，大家也把目光聚集在沙利度胺是否能夠通過抑制炎癥反應來減少氧化應激損傷時內皮細胞的損傷。故本研究希望用LPS構建體外炎癥的模型來探討沙利度胺的抗氧化應激的效果，但是由于各個實驗室的藥品、細胞培養(yǎng)條件等的差異，我們需要篩選出適合本實驗室研究的模型條件。通過流式細胞術的結果顯示，低濃度的LPS即可引起HUVEC的凋亡，但是并不能達到炎癥模型的要求，最后發(fā)現(xiàn)在相同時間點0.25、0.5 mg/L LPS處理后的凋亡率基本沒有改變，但是1 mg/L LPS在處理24 h后的凋亡率可以達到92%，另外在各個時間點2 mg/L LPS與1 mg/L LPS處理后的凋亡率基本相同。故最終確定LPS造模濃度為1 mg/L,時間為24 h。此外為了確定沙利度胺在發(fā)生炎癥和氧化應激損傷時的保護作用，我們首先篩選了沙利度胺的無細胞毒性的濃度范圍，確定其無細胞毒性濃度范圍

為0～125 mg/L。此外我們還測定了沙利度胺的最佳預處理時間，100 mg/L沙利度胺分別預處理6、12、24 h后，再加入1 mg/L LPS處理24 h后測定其凋亡率，結果顯示，預處理6、12、24 h之間的凋亡率沒有明顯變化，但是與模型組相比，凋亡率降低。之后我們又測定了不同濃度的沙利度胺對于LPS引起的氧化應激損傷的保護作用，發(fā)現(xiàn)隨著沙利度胺濃度的提高，凋亡率下降，說明沙利度胺在氧化應激反應損傷中起到了保護作用，且與濃度呈正相關。

綜上，我們確定了LPS體外炎癥模型的建立和沙利度胺的預處理時間和濃度，為在炎癥發(fā)生時尋求更好的保護方式提供了更好的思路，同時也為沙利度胺更好地服務于臨床打下了理論基礎。但是沙利度胺具體的保護機制還有待進一步的研究。

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