陳俊生，董 琪,曹玉祥，吳志浩

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院 精準醫(yī)學(xué)興趣小組,蕪湖 安徽 241002；3.皖南醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；4.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；5.皖南醫(yī)學(xué)院 細胞生物學(xué)教研室，生物活性大分子重點實驗室，安徽 蕪湖 241002)

煙草的使用是全世界主要的公共衛(wèi)生問題，與煙草有關(guān)的癌癥每年造成數(shù)百萬人死亡，其中肺癌患者占絕大多數(shù)[1]。4-甲基亞硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(4-methylnitrosamino-1-3-pyridyl-1-butanone，NNK)是煙草中重要的致癌物質(zhì)，其在體內(nèi)可被代謝為強致癌物4-羥基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮[2]。在細胞中發(fā)生了這些復(fù)雜的生化反應(yīng)的結(jié)果是NNK廣泛地誘導(dǎo)DNA損傷[3-5]。

毛細血管擴張-共濟失調(diào)突變基因(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM) 定位于染色體11q22-23，長度為13 kb，其中含有66個外顯子，編碼一個13 kb長度的mRNA。其編碼產(chǎn)物為ATM蛋白，屬于一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，含有3056個氨基酸殘基，是一種分子質(zhì)量為350 ku大分子量蛋白，ATM是磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶(PIKK)家族的成員，其在DNA雙鏈斷裂(DSB)誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)中起主要作用[6-7]。在細胞受到DNA雙鏈損傷時，它能被磷酸化激活并啟動雙鏈修復(fù)阻止細胞周期的進程[4]。因此，研究其活性調(diào)控及蛋白表達的機制具有重要的臨床意義。目前關(guān)于ATM基因表達的相關(guān)機制還尚未明確，為了后續(xù)探究ATM信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)分子機制，我們構(gòu)建了人源ATM基因啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒，并對其活性進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人非小細胞肺癌細胞H1299為本實驗室凍存；DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)；小牛血清(南京博全科技有限公司)；polyjet(SignaGen公司)；E.coli DH5α Competent Cells(TaKaRa 公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、PGL3-Basic 質(zhì)粒(Promega公司)；T4 DNA連接酶、KpnⅠ和NheⅠ(NEWENGLAND BioLabs)；p-ATM、ATM和β-actin抗體以及二抗(CST公司)；DNA Maker、質(zhì)粒小量提取試劑盒(碧云天公司)；質(zhì)粒中提試劑盒(QIAGEN公司)；基因組DNA提取試劑盒和Taq PCR MasterMix(TIANGEN公司)；顯影液(MILLIPORE公司)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測ATM蛋白的表達量 適量的細胞接種于六孔板中，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待長滿后以DMEM饑餓12 h，再以1 μmol/L的NNK不同時間段處理(濃度為本實驗室前期探索[8])，4 h后收樣。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠上分離，轉(zhuǎn)膜后，用脫脂牛奶封閉1 h，然后用一抗過夜孵育，再以二抗孵育1 h，最后涂以適量顯影液進行成像。

1.2.2 ATM啟動子的克隆 H1299細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。待長滿后，用基因組DNA提取試劑盒制備H1299細胞基因組DNA，具體步驟按照操作手冊進行。通過UCSC網(wǎng)站，找到人ATM基因啟動子序列，設(shè)計出一對引物，上游為5′-CCGGTACCCCTGACAGACAAGTGACCCACAAACA-3′，下游為5′-CTAGCTAGCAGAAGCAACGCCAAGCAGCCGCAGAGC-3′。以提取的H1299細胞基因組DNA為模板，PCR條件：預(yù)變性94℃、3 min;變性94℃、30 s，退火60℃、30 s，延伸72℃、60 s，共30個循環(huán)，延伸72℃、5 min，擴增后的產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。將上述克隆的ATM啟動子片段和PGL3-Basic分別經(jīng)KpnⅠ、NheⅠ雙酶切、連接，然后進行轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落做菌落PCR鑒定其陽性的克隆，然后陽性的克隆再次進行搖菌，保種后進行質(zhì)粒提取、酶切并送往上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3 利用GraphPad Prism 6軟件對實驗中的數(shù)據(jù)進行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ATM啟動子克隆成功 將擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，出現(xiàn)了預(yù)估的條帶，說明擴增成功(圖1A)。將構(gòu)建好的質(zhì)粒進行KpnⅠ、NheⅠ雙酶切，出現(xiàn)了兩條帶，分別與載體和片段的分子量相同(圖1B)，上海生工生物工程有限公司的測序結(jié)果更加說明了ATM啟動子克隆成功。

A：1.PCR擴增產(chǎn)物，M.DNA Maker DL2000。

B：1.所構(gòu)建質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，M.DNA Maker DL5000。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2 NNK對于ATM蛋白的表達有抑制作用 用1 μmol/L的NNK以不同時間段處理H1299細胞，我們發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，NNK對于ATM的抑制逐漸增強而NNK在3 h和6 h增加了p-ATM的活性，之后隨著時間的增加p-ATM的活性減弱，這可能是因為NNK抑制ATM的總蛋白表達量，繼而影響到p-ATM的量(圖2)。

1 μmol/L的NNK以不同時間段處理的H1299細胞中ATM與p-ATM的表達量。

圖2 Western Blot檢測結(jié)果

2.3 NNK在轉(zhuǎn)錄水平上抑制ATM基因的表達 將構(gòu)建的ATM啟動子報告基因轉(zhuǎn)入H1299細胞中，以1 μmol/L的NNK處理4 h，結(jié)果顯示NNK抑制ATM啟動子的活性(圖3)。

Control：0.7380 ± 0.0594，n=3；1 μmol/L NNK：0.5015 ± 0.0147，n=3；t=3.865，P=0.0289，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測H1299細胞中NNK對ATM啟動子活性的影響

3 討論

我國屬于肺癌多發(fā)國，多達90%的肺癌可歸因于吸煙或二手煙，其中煙草致癌物質(zhì)NNK已被國際癌癥研究機構(gòu)列為第1類人體致癌物質(zhì),吸煙導(dǎo)致肺癌的現(xiàn)狀不容樂觀。NNK已在體內(nèi)外的實驗中被證明和肺癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。在動物模型中，NNK是唯一系統(tǒng)誘導(dǎo)小鼠、大鼠以及倉鼠肺部腫瘤的強致癌物。NNK是來源于煙草加工過程中所產(chǎn)生的亞硝胺類物質(zhì)。在體內(nèi)，經(jīng)過細胞色素p450的作用導(dǎo)致了NNK的羥基化，產(chǎn)生了4-羥基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(HPB)，促進了DNA加合物的生成，進而會導(dǎo)致核苷酸的替代、缺失或染色體的重排[9-10]。NNK不僅誘導(dǎo)了DNA的突變，同時可以影響細胞內(nèi)多種信號通路。研究表明，EGFR、AKT、MAPK、NF-κB 等細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑都可以被NNK所激活[9]。我們實驗室前期的工作發(fā)現(xiàn),NNK可以和尼古丁乙酰膽堿受體結(jié)合誘導(dǎo)AKT和ERK1/2信號通路，進而誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的表達[8,10]。由NNK誘導(dǎo)的DNA突變及染色體變化無疑會導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)的激活。這與我們發(fā)現(xiàn)的p-ATM在NNK處理早期呈上升趨勢的結(jié)果一致。ATM在細胞內(nèi)與NBS1以及BRCA1形成BRSC復(fù)合物(BRCA1-Associated Genome Surveillance Complex)起到監(jiān)視DNA損傷的作用。當(dāng)DNA受到損傷時，ATM蛋白激酶會被磷酸化激活，激活的ATM蛋白激酶會激活下游一系列控制細胞周期的蛋白底物，如p53、chek2、chek1、Nhb1等，以此來使細胞周期停滯，為DNA損傷的修復(fù)贏得時間[11]。因此，ATM在修復(fù)NNK誘導(dǎo)的DNA損傷中起到關(guān)鍵作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，NNK抑制ATM蛋白表達呈時間依賴性，同時我們發(fā)現(xiàn)NNK可以在轉(zhuǎn)錄水平上抑制ATM啟動子的活性。根據(jù)本實驗室及國內(nèi)外其他實驗室工作的結(jié)果，我們推測NNK有可能影響了某個信號通路的功能進而抑制了ATM蛋白的表達，其具體分子機制目前正在加緊研究中。

本項研究證實了NNK對ATM總蛋白的表達有抑制作用，這有可能導(dǎo)致大范圍的DNA損傷不能被修復(fù)，因此，我們認為NNK抑制ATM是肺癌發(fā)生發(fā)展的可能機制之一。本實驗為探究NNK在非小細胞肺癌細胞中有關(guān)ATM信號通路的分子機制奠定了基礎(chǔ)，進一步探究NNK對ATM活性及表達的調(diào)節(jié)對了解煙草如何誘導(dǎo)肺癌的發(fā)生具有重要意義，若能更清楚地了解ATM基因和ATM蛋白的功能，可為ATM作為治療吸煙所致肺癌的新靶點提供更準確可靠的理論依據(jù)。

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