劉 媛，王文博，鄒自英，邱 薇，范泉水，馮子良，熊 杰

人腺病毒（human adenovirus，HAdV）是一類無包膜的雙鏈DNA病毒，分為A～G 7個(gè)血清學(xué)組，60多個(gè)血清型。其中B組腺病毒感染目前已成為急性呼吸系統(tǒng)疾病的重要病原，其中引起軍隊(duì)新兵呼吸道感染流行的主要是腺病毒3型、7型和55型[1-5]。其中55型腺病毒（HAdV-55）是基于HAdV-B14型基因組骨架嵌合HAdV-B11型Hexon部分片段的重組新病毒，屬于B組的B2亞組。該病毒第一次在我國(guó)引起感染疫情發(fā)生在2006年3～4月陜西岐山縣[3]。近年來，HAdV-B55在成人特別是在學(xué)校和軍隊(duì)特殊人群中，引起日益頻繁的急性呼吸道傳染病流行[4-5]。另外也有研究表明，HAdV-55感染是成人社區(qū)獲得性肺炎的重要病因之一，成人腺病毒肺炎流行有明顯季節(jié)性，多在每年的2～3月份流感流行后期發(fā)生[6]。

由于腺病毒屬于DNA病毒，且沒有包膜，病毒本身比較穩(wěn)定，能夠在環(huán)境中存活時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。為了解紫外線和熱力對(duì)HAdV-55的滅活效果，本研究開展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人喉癌上皮細(xì)胞HEp-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室保存培養(yǎng)；GIBCO胎牛血清、DMEM、青/鏈霉素、Invitrogen PureLinkTMViral RNA/DNA Mini Kit購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；引物和PCR試劑購(gòu)自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司；生化試劑購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 HAdV-55毒株 病毒毒株SF04/SC/2016為本實(shí)驗(yàn)室前期從HAdV-55感染者咽拭子標(biāo)本中分離獲得，按照Reed-Muench公式計(jì)算病毒滴度為2.5×105，具體信息見參考文獻(xiàn)[7]。

1.3 紫外線對(duì)HAdV-55的滅活試驗(yàn) 取100μl病毒液（滴度為2.5×105）平鋪于48孔板底部，均勻涂布孔底，形成一層薄層，隨機(jī)分為紫外照射30min組、1 h組和2 h組及對(duì)照組。紫外照射組置于超凈臺(tái)紫外燈下，紫外線波長(zhǎng)254 nm，功率20瓦（W），距離60 cm，分別照射30min、1 h和2 h；對(duì)照組不進(jìn)行紫外線照射。紫外線照射組照射完成后，采用實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）法檢測(cè)病毒液中HAdV-55 DNA水平。然后將4組分別接種HEp-2細(xì)胞，1×105個(gè)/孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒DNA水平；培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞上清，采用Reed-Muench法檢測(cè)上清液中病毒滴度。

1.4 熱力對(duì)HAdV-55的滅活試驗(yàn) 將100μl病毒（滴度為2.5×105）加入1.5 ml離心管中，隨機(jī)分為熱力滅活30min組、1 h組和2 h組及對(duì)照組。熱力滅活組置于恒溫水浴鍋內(nèi)，溫度設(shè)置為65℃，時(shí)間分別為30 min、1 h和2 h，對(duì)照組不進(jìn)行熱力滅活，置于4℃暫存。熱力處理完成后，采用RT-PCR法檢測(cè)病毒液中HAdV-55 DNA水平。然后將4組病毒液各100μl分別置于48孔板中，接種HEp-2細(xì)胞，細(xì)胞密度 1×105個(gè)/孔，于 37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此后，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒的檢測(cè)方法和步驟同1.3。

1.5 RT-PCR方法 采用Invitrogen PureLinkTMViral RNA/DNA Mini Kit提取上述病毒分離液的腺病毒DNA，具體操作參照說明書進(jìn)行。建立HAdV-55DNA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)提取的腺病毒DNA水平進(jìn)行定量檢測(cè)。相對(duì)定量以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用ΔΔCt法分析各組HAdV水平。所用引物如下，HAdV-F：5'-AGATGAAGAAAGTAAACCGATTT-3'；HAdV-R：5'-CCATCAAGGTCAGTCCAA-3'，預(yù)期產(chǎn)物86 bp；GAPDH-F：5'-TGGGCTACACTGAGCACCA G-3'，GAPDH-R：5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3'，預(yù)期產(chǎn)物 100 bp。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS 15.0軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間差異采用單因素方差分析，兩組間比較采用Tukey檢驗(yàn)，假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 紫外線對(duì)HAdV-55的滅活效果 紫外線照射30min、1 h和2 h后，紫外線照射組HAdV-55 DNA水平與對(duì)照組相比無顯著差異（P＞0.05，圖1A）。但紫外線照射組病毒感染HEp-2細(xì)胞水平降低，與對(duì)照組相比，紫外線照射30 min組細(xì)胞內(nèi)病毒DNA水平降低約50%；紫外線照射1 h和2 h組細(xì)降低約 2個(gè)數(shù)量級(jí)（P＜0.05，圖1B）。

進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中子代病毒滴度，結(jié)果顯示，對(duì)照組子代病毒滴度為（2.5±0.10）×105，紫外線照射30min組、1 h組和2 h組分別為（1.9±0.08）×103、（5.7±0.08）×10 和（2.3±0.05）×10。見圖 2。

圖2 各組子代病毒滴度比較

2.2 熱力對(duì)HAdV-55的滅活效果 65℃熱力滅活30min、1 h和2 h后，熱力滅活組HAdV-55 DNA水平與對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.05，圖3A）。熱力滅活組病毒感染HEp-2細(xì)胞水平也降低，65℃處理30 min、1 h和2 h，病毒感染HEp-2水平降低＞104個(gè)數(shù)量級(jí)（P＜ 0.05，圖 3B）。

熱力滅活病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生子代病毒的滴度也顯著降低。65℃處理30min病毒組感染細(xì)胞產(chǎn)生的子代病毒滴度為（2.04±0.06）×101；而 1 h 組和 2 h組產(chǎn)生的子代病毒，不能再次感染細(xì)胞。

3 討論

人腺病毒屬腺病毒科，是無包膜的DNA病毒，病毒的核心由雙鏈DNA及蛋白質(zhì)組成，病毒的衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)，直徑80～110 nm。人腺病毒無類脂質(zhì)包膜，耐乙醚和氯仿等脂溶性消毒劑，耐酸，在環(huán)境中穩(wěn)定性相對(duì)較高。由于病毒的有效滅活涉及到病毒的傳播和控制、生物安全等多個(gè)方面，因此，探討紫外線和熱力對(duì)腺病毒的滅活效果具有重要意義。

目前腺病毒的滅活主要使用含氯消毒劑。李杰等[8]研究了常用消毒劑對(duì)HAdV-55的滅活效果，發(fā)現(xiàn)用含有效氯400 mg/L的次氯酸鈉和600mg/L的過氧乙酸作用20min，或含有效碘1000mg/L的碘伏溶液作用40min，對(duì)HAdV-55的滅活對(duì)數(shù)值可≥4.00；而醋酸氯己定和苯扎氯銨等低效消毒劑對(duì)該病毒的滅活作用稍弱。

圖1 紫外照射對(duì)HAdV-55活力的影響

圖3 熱力滅活對(duì)HAdV-55病毒活力的影響

楊玲等[9]報(bào)道了紫外線照射對(duì)腺病毒氣溶膠活力和粒級(jí)分布的影響，采用HEK293包裝細(xì)胞制備綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組腺病毒，通過在熒光顯微鏡計(jì)數(shù)帶綠色熒光的PKl5細(xì)胞數(shù)以檢測(cè)病毒的感染力及活力，發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)為254 nm的紫外線照射5 min時(shí)，細(xì)胞內(nèi)感染的病毒數(shù)即明顯減少；254 nm紫外線照射30min時(shí)，感染細(xì)胞內(nèi)不能檢測(cè)到綠色熒光。該研究還發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)為254 nm的紫外線比365 nm的紫外線照射滅活腺病毒氣溶膠的效果更顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)，波長(zhǎng)254 nm的紫外線照射HAdV-55，對(duì)病毒DNA水平影響不大，但顯著降低病毒的感染活力。紫外線照射30 min后，細(xì)胞內(nèi)病毒DNA水平降低約50%；照射1 h和2 h，細(xì)胞內(nèi)病毒DNA水平降低約2個(gè)數(shù)量級(jí)，而且病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生子代病毒的滴度也顯著降低，均證明紫外線照射可在一定程度上滅活腺病毒，采用紫外線照射能在一定程度上控制腺病毒的傳播。但由于實(shí)驗(yàn)條件所限，本研究采用的紫外燈功率為20W，照射距離為60 cm，僅設(shè)置了照射時(shí)間一個(gè)變量。此外，由于紫外滅活的效果與時(shí)間、距離、功率、環(huán)境溫度、濕度等都有關(guān)，因此，在實(shí)際工作中，可通過適當(dāng)延長(zhǎng)紫外照射時(shí)間、縮短照射距離、提高照射功率等方法，提高滅活效果。

文獻(xiàn)報(bào)道，不同溫度對(duì)病毒滅活強(qiáng)弱效果也有差異[10-11]，65℃滅活病毒可作為篩選滅活疫苗株的一個(gè)條件。本研究結(jié)果顯示，熱力對(duì)HAdV-55的滅活作用較強(qiáng)，65℃處理30 min后，病毒感染水平的對(duì)數(shù)值降低4.0左右，產(chǎn)生子代病毒的滴度顯著降低；65℃處理1 h和2 h后，HAdV-55感染細(xì)胞產(chǎn)生的新病毒極少。因此，對(duì)腺病毒污染物品進(jìn)行加熱消毒是可行且有效的。

254 nm紫外線和65℃熱力對(duì)HAdV-55均有不同程度的滅活作用，其中紫外線照射可作為實(shí)驗(yàn)室空間整體消毒的一種方法，熱力滅活可作為篩選滅活疫苗株的一種手段，其中65℃熱力對(duì)HAdV-55處理1 h以上可使其不能產(chǎn)生子代病毒，為后續(xù)研究HAdV-55滅活疫苗提供參考。

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