李森茂，李 昂，胡 嘏，余 虓，王少剛，葉章群

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科,湖北武漢 430030)

微小RNA(miRNA)是一種進(jìn)化上保守的內(nèi)源性的小非編碼RNA，主要通過靶向結(jié)合3＇-UTR，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和蛋白的翻譯來發(fā)揮作用[1]。在過去的十幾年里，很多體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[2]，有些miRNA已被提出作為癌癥治療的新型潛在靶標(biāo)[3]。目前為止，有研究表明miR-449a在多種腫瘤中呈現(xiàn)較低表達(dá)，包括肝癌、胃癌等，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[4-5]。本實(shí)驗(yàn)旨在探究miR-449a在前列腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，觀察在前列腺癌細(xì)胞株中過表達(dá)miR-449a對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響，并研究此過程細(xì)胞中一些凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1材料miR-449a mimics和隨機(jī)對(duì)照序列(dsControl)(廣州市銳博生物科技有限公司)；人前列腺永生化上皮細(xì)胞RWPE-1以及人前列腺癌細(xì)胞系PC3、 DU145和LnCap(中國(guó)武漢典型培養(yǎng)物保藏中心)；胎牛血清、Opti-MEM?無血清培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、K-SFM無血清培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)； Lipofectamine?RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑、溴化丙啶(PI)(美國(guó)Invitrogen公司)；PCR引物合成、All-in-oneTMmiRNAqPCR Kit (廣州復(fù)能基因公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；一抗鼠抗B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、一抗兔抗Bcl-2相關(guān)蛋白X(Bax)、天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)(美國(guó)Affinity公司)、激活型天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；一抗鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG(武漢博士德公司)；超敏ECL發(fā)光試劑盒(美國(guó)Millipore公司)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜；RNA酶A(美國(guó)Sigma公司)；凱基細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物股份有限公司)，Caspase3/7活細(xì)胞熒光實(shí)時(shí)法檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物股份有限公司)。

1.2組織樣本及細(xì)胞培養(yǎng)前列腺癌組織標(biāo)本及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本均取于本院泌尿外科進(jìn)行前列腺癌根治切除術(shù)患者的術(shù)后組織，切取標(biāo)本均獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并且提前向患者本人簽署知情同意。組織手術(shù)切除后，經(jīng)具較高資格醫(yī)師指導(dǎo)下，分辨出癌組織和癌旁組織，并分別切取較小直徑組織塊，數(shù)秒內(nèi)裝入預(yù)先做好標(biāo)記的凍存管，隨即放入液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱存留備用。人前列腺永生化上皮細(xì)胞RWPE-1于含0.05 mg/mL牛垂體提取物(bovine pituitary extract,BPE)及5 ng/mL人重組表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)的K-SFM無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，人前列腺癌細(xì)胞系PC3、DU145、LnCap細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.3dsRNA、miRNA序列的選擇和細(xì)胞轉(zhuǎn)染dsControl是一組已知的缺少人類基因重要同源性的dsRNA，正義鏈：5′ACUACUGAGUGACAGUAGA[dT][dT]3′；反義鏈：5′UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT] 3′；miR-449a的序列為：3′UGGUCGAUUGUUAUGUGACGGU5′。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度約為60%。根據(jù)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的不同處理分為2組：陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染dsControl)、實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-449a mimics)。接種板12 h后，采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?RNAiMAX進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，保證dsRNA或miRNA的終濃度為75 nmol/L。24 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)并及時(shí)更換含血清培養(yǎng)基。

1.4總RNA的提取和qPCR分析將轉(zhuǎn)染72 h后收集的細(xì)胞以及在液氮中研磨成粉末的組織置于1.5 mL的離心管中，利用Trizol法提取細(xì)胞和組織中總RNA，然后分析細(xì)胞和組織中miR-449a的表達(dá)水平。miR cDNA合成參照廣州復(fù)能基因All-in-oneTMmiRNAqPCR Kit試劑盒說明操作，反應(yīng)條件為：①預(yù)變性：95 ℃、10 min、1個(gè)循環(huán)；②PCR擴(kuò)增：共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括變性(95 ℃、10 s)、退火(60 ℃、20 s)、延伸(72 ℃、20 s)。利用MX3000P熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行上述實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)及檢測(cè)，U6 snRNA作為內(nèi)參。結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法分析。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染72 h后，離心收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)基；用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次(2 000 r/min，離心時(shí)間5 min收集細(xì)胞)；用200 μL 緩沖液懸浮細(xì)胞，然后分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育10 min,在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.6總蛋白的提取和Westernblot實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞用于蛋白表達(dá)的分析。用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗2遍，棄上清，加入含有蛋白酶抑制劑(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA裂解液，置于冰上(4 ℃)裂解30 min，12 000 g離心15 min收集上清。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)樣本加25 μg蛋白至SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜后用含5%牛血清白蛋白的TBST溶液室溫封閉1 h后，分別與一抗鼠抗Bcl-2(1∶1 000)、兔抗Bax(1∶1 000)、兔抗Caspase-3(1∶1 000)、兔抗Cleaved caspase-3(1∶1 000)、鼠抗β-Actin(1∶500) 4 ℃孵育過夜。第2天采用羊抗鼠的二抗(1∶5 000)、羊抗兔的二抗(1∶5 000)孵育1 h，使用ECL曝光顯影。

1.7Caspase3/7活細(xì)胞熒光時(shí)實(shí)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后，用新鮮的培養(yǎng)基輕輕洗滌細(xì)胞3次，最后加入2 mL新鮮培養(yǎng)基，加入2 μL Caspase3/7檢測(cè)液，37 ℃避光孵育30 min,然后熒光顯微鏡下觀察并拍照計(jì)數(shù)、分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1miR-449a在前列腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)RT-qPCR結(jié)果顯示，miR-449a在9對(duì)前列腺癌組織和癌旁組織中，其信使RNA的相對(duì)表達(dá)量平均值分別為(0.481±0.055)、(0.951±0.039)；miR-449a在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯降低，與癌旁組織中表達(dá)相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。檢測(cè)前列腺上皮細(xì)胞株RWPE-1和PC3、DU145、LnCap前列腺癌細(xì)胞系中miR-449a信使RNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.967±0.062)、(0.24±0.07)、(0.493±0.089)、(0.431±0.088)；與正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1中miR-449a信使RNA的表達(dá)相比較，前列腺癌細(xì)胞系中miR-449a信使RNA的表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，在前列腺癌組織和細(xì)胞系中，miR-449a均呈較低表達(dá)，我們選擇PC3、DU145細(xì)胞繼續(xù)后面實(shí)驗(yàn)研究(圖1)。

圖1前列腺癌組織及細(xì)胞系中miR-449amRNA相對(duì)表達(dá)情況

與正常組織相比較，*P<0.05，**P<0.01；A：RT-qPCR檢測(cè)前列腺組織中miR-449a的相對(duì)表達(dá)量,橫坐標(biāo)字母A～I(xiàn)分別表示一對(duì)正常組織和癌組織；B：RT-qPCR檢測(cè)前列腺組織中miR-449a相對(duì)內(nèi)參U6的表達(dá)量均值；與RWPE-1細(xì)胞相比較，**P<0.01，***P<0.001；C：RT-qPCR檢測(cè)各細(xì)胞中miR-449a的相對(duì)表達(dá)量。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-449a mimics 72 h后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中PC3細(xì)胞的凋亡率分別為(4.827±0.756)%、(21.691±1.813)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.32,P<0.05)；DU145細(xì)胞的凋亡率分別為(3.79±0.72)%、(13.88±0.712)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=483.22,P<0.05)。兩組結(jié)果說明了miR-449a具有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用(圖2)。

圖2miR-449a對(duì)PC3和DU145細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC3細(xì)胞凋亡；B：PC3細(xì)胞凋亡率；C：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DU145細(xì)胞凋亡；D：DU145細(xì)胞凋亡率。

2.3Caspase3/7活細(xì)胞熒光時(shí)實(shí)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染miR-449a mimics 72 h后，與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組中PC3 和DU145細(xì)胞在熒光顯微鏡下，綠色熒光強(qiáng)度明顯較強(qiáng)，說明實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞凋亡的程度較嚴(yán)重，即說明了miR-449a具有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡的作用(圖3)。

圖3采用Caspase3/7活細(xì)胞熒光時(shí)實(shí)法檢測(cè)PC3和DU145不同處理組細(xì)胞的凋亡情況

(綠色熒光的強(qiáng)弱表示凋亡的程度，×100)

2.4Westernblot檢測(cè)各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染miR-449a mimics 72 h后，前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145細(xì)胞中，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，而Bax、Caspase-3、Cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4miR-449a對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響

與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；A：Western blot法檢測(cè)PC3細(xì)胞中蛋白表達(dá)；B：PC3細(xì)胞中Bcl-2、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)柱狀圖；C：Western blot法檢測(cè)DU145細(xì)胞中蛋白表達(dá)；D：DU145細(xì)胞中Bcl-2、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)柱狀圖。

3 討 論

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)水平的提高，前列腺癌的發(fā)生率在我國(guó)呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)，愈發(fā)引起關(guān)注[6]。研究表明，多種miRNA在前列腺癌中有比較重要的作用，但是大部分與前列腺癌密切相關(guān)的miRNA還不是很明確。本研究首先通過分析檢測(cè)9對(duì)前列腺癌組織及癌旁組織中miRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)miR-449a在癌組織中明顯降低，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果較一致。我們進(jìn)一步檢測(cè)了幾種常見前列腺癌細(xì)胞株和人正常前列腺上皮細(xì)胞中miR-449a的表達(dá)，結(jié)果證明了在前列腺癌細(xì)胞系中miR-449a也呈較低表達(dá)。

大量研究證實(shí)，miRNA參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等重要生物學(xué)過程，有些miRNA的表達(dá)在前列腺癌中降低，卻對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[7]。NOONAN等[8]早年已經(jīng)報(bào)道了miR-449a能夠通過靶向HDAC1抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。近年又有研究表明，miR-449a也能夠增強(qiáng)前列腺癌對(duì)放療的敏感性，提高放療治療效果[9]。最近，有研究證實(shí)了miR-449a能夠調(diào)節(jié)前列腺癌的轉(zhuǎn)移，對(duì)早期診斷有一定的價(jià)值[10]。但是，miR-449a對(duì)前列腺癌凋亡的機(jī)制研究目前還沒有報(bào)道，本研究通過轉(zhuǎn)染技術(shù)而過表達(dá)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145中miR-449a，研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，miR-449a明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)檢測(cè)各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白表達(dá)下降較顯著，而Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)卻上調(diào)了。

Bcl-2是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠通過抑制細(xì)胞色素C從線粒體膜間隔釋放到細(xì)胞質(zhì)中而發(fā)揮其抗凋亡功能[11]。有軟件預(yù)測(cè)Bcl-2很有可能是miR-449a的一個(gè)靶向結(jié)合基因[12]，而miRNA能夠與靶基因mRNA 3＇-UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究證實(shí)，miR-449a通過靶向作用Bcl-2基因，能夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡[13]，同時(shí)也能夠調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖和對(duì)化療藥物的敏感性[14]。有資料顯示，在多種腫瘤細(xì)胞的凋亡過程中，發(fā)現(xiàn)有Caspase的活化[15-16]，Caspase是一個(gè)半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡的過程中起著關(guān)鍵性的作用，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游如Caspase-3、Caspase-7等，能被上游的始動(dòng)子激活作用于特異性底物，使細(xì)胞發(fā)生生化及形態(tài)學(xué)改變導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列與Caspase有關(guān)而誘導(dǎo)凋亡的方法來治療腫瘤，可望在惡性腫瘤的治療方面取得新的突破[17]。因此，我們推測(cè)miR-449a的異常表達(dá)可能與前列腺癌具有相關(guān)性，可能是通過下調(diào)靶基因Bcl-2的表達(dá)而引起B(yǎng)ax蛋白的改變，同時(shí)激活了Caspase-3蛋白的表達(dá)，最終引起了前列腺癌細(xì)胞的凋亡。當(dāng)然，miR-449a可能也有很多其他的靶基因，通過改變這些個(gè)基因的表達(dá)引起細(xì)胞凋亡，這也是今后繼續(xù)研究的方向和切入點(diǎn)。

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