，，，

(1.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學院，福建 廈門 361100；2.國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005；3.國家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361005；4.廈門大學，福建 廈門 361005；5.東山出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，福建 東山 363400)

金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類普遍存在于生物體內(nèi)的、高度可誘導性的內(nèi)源金屬結(jié)合蛋白，具有維持生物體內(nèi)必須金屬含量動態(tài)平衡、重金屬解毒、清除自由基，改善機體免疫力、增強機體抗應(yīng)激能力等多種作用[1-3]，且與動物機體的生長發(fā)育及部分疾病的發(fā)病機理有著密切的關(guān)系。因此，MT在醫(yī)學、化妝品、保健食品添加劑、環(huán)保等方面得到了廣泛應(yīng)用。

目前，國內(nèi)市場上常見的MT多數(shù)是從兔肝臟中提純[4]，提取工藝中使用大量有機溶劑[5-7]，且步驟繁復(fù)，產(chǎn)量極低，致使MT的價格極其昂貴，從而使其應(yīng)用和研究受到限制。采用基因重組技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)制備金屬硫蛋白，對其大規(guī)模開發(fā)和作用機理的研究有重要意義。目前利用大腸桿菌作為工業(yè)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的優(yōu)選宿主細胞研究MT表達方法多有文獻報道[8-9]，但其缺少蛋白翻譯后進行加工和修飾的功能，且目的蛋白極易形成包涵體，分離純化繁瑣，給生產(chǎn)實踐帶來困難。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種傳統(tǒng)的酶制劑工業(yè)生產(chǎn)菌株，具有可操作性強、發(fā)酵周期短的優(yōu)點，可直接將表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，也是分泌表達外源基因的良好受體菌[10-11]。同時枯草芽孢桿菌不分泌內(nèi)毒素，具有較好的生物安全性，是美國FDA和我國農(nóng)業(yè)部批準使用的食品安全菌種，其發(fā)酵產(chǎn)物可直接用于食品生產(chǎn)中。近年來枯草芽孢桿菌作為外源基因表達的宿主系統(tǒng)發(fā)展迅速并展現(xiàn)出良好的工業(yè)應(yīng)用前景[12-16]。

濾食性的底棲雙殼類海洋動物對重金屬有較強的生物累積能力，海洋貝類MT對重金屬具有高敏感的應(yīng)激效應(yīng)[17-22]，且相對于陸地源MT，海洋源MT具有獨特的化學結(jié)構(gòu)和特殊的生物活性。本研究旨在解決制約MT產(chǎn)業(yè)發(fā)展原料來源瓶頸，應(yīng)用基因重組技術(shù)，將褶牡蠣(Ostreaplicatula)金屬硫蛋白基因全長序列Op-MT，插入到表達載體pHT43-SUMO的相應(yīng)位點，并轉(zhuǎn)入八種蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌WB800N，擬構(gòu)建安全高效分泌表達的重組枯草芽孢桿菌MT基因工程菌。以期能獲得具高安全性、高產(chǎn)量和高活性的高純目標蛋白，使海洋源MT具有極大地應(yīng)用于實際工業(yè)生產(chǎn)潛能，為天然高效重金屬生物解毒劑的成功開發(fā)和推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800N為廈門大學某博士惠贈，E.coliDH-5α購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒載體pMD19-Tvector購自寶生物工程(大連)有限公司，枯草芽孢桿菌表達載體pHT43為本實驗室保藏。E.coliDH-5α和枯草芽孢桿菌生長和發(fā)酵培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。

1.1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、PCR反應(yīng)試劑、限制性內(nèi)切酶SacII/BamHI/SmaI、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，胰蛋白胨、酵母浸提粉(英國OXOID 公司產(chǎn)品)購自廈門綠茵公司，氨芐青霉素、氯霉素、新霉素為Solarbo公司產(chǎn)品。PCR引物及DNA測序均由上海生物工程技術(shù)有限公司完成。氯化鎘(CdCl2)購自廈門綠茵試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 褶牡蠣金屬硫蛋白基因的克隆以及分泌表達載體的構(gòu)建

運用TRIzol試劑盒提取褶牡蠣內(nèi)臟團總RNA，采用TaKaRa Prime-Script TM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa，Japan)進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)GeneBank褶牡蠣金屬硫蛋白基因序列Op-MT(登錄號：KP875559)設(shè)計引物(表1，F(xiàn)1/R1)，PCR擴增Op-MT基因序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收、連接至克隆載體pMD-19，并轉(zhuǎn)化到E.coliDH-5α中，送至上海生物工程技術(shù)進行序列測定。用BamHI/SmaI酶切質(zhì)粒pMD-19-Op-MT和pHT43-SUMO表達載體，各自膠回收后用T4 DNA連接酶并轉(zhuǎn)化到E.coliDH-5α細胞，在含有100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子并加以驗證。

1.2.2 重組工程菌構(gòu)建和篩選

以枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800N為表達宿主，用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化分泌表達載體pHT43-SUMO，在含有10 μg/mL氯霉素和50 μg/mL新霉素的LB平板上篩選。得到陽性轉(zhuǎn)化子菌株，命名為B.subtilisWB800N/pHT43-SUMO-Op-MT(圖1)。

將B.subtilisWB800N/pHT43-SUMO-Op-MT接種到LB液體培養(yǎng)基(10 μg/mL氯霉素和50 μg/mL新霉素)中，37℃培養(yǎng)過夜，收集菌液并提取總DNA，以F2/R2(表1)為引物進行PCR鑒定。

表1 褶牡蠣金屬硫蛋白cDNA克隆測序及PCR中所用引物

1.2.3 融合蛋白誘導表達和分離純化

100 mL WB800N/pHT43-SUMO-Op-MT菌液擴大誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃，4 h，1 mmol/L IPTG，220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8～1.0。2、4 h分別離心收集發(fā)酵液上清，進行SDS-PAGE凝膠電泳定性，分離膠12%，濃縮膠5%。另一組空白B.subtilisWB800N作為對照。電泳結(jié)束后凝膠染色4～6 h，將脫色后的凝膠保存于去離子水中，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照。

對發(fā)酵液進行His-tag標簽親和純化。首先，用3個柱體積的TBS(pH 8.0)緩沖液平衡鎳柱。然后，將上清液上樣，流速約為1 mL/min。上樣完畢后，再用3個柱體積的TBS(含50 mmol/L 咪唑，pH 8.0)進行洗滌；隨后，用洗脫緩沖液(含300 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫目的蛋白，收集各個洗脫峰進行12%的SDS-PAGE凝膠電泳檢測。最后利用Bradford method定量目的蛋白。

1.2.4 融合蛋白的 Western blotting鑒定

將重組工程菌誘導表達48 h后的發(fā)酵液和空白對照組(B.subtilisWB800N)的發(fā)酵液，經(jīng)丙酮沉淀后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)：300 mA，1 h)，用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加入用 TBST(Tris 緩沖鹽-吐溫溶液，含10 mmol/L pH 7.6 Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、0.05% 土溫-20)1∶10 000 稀釋的 His 一抗，37℃ 孵育1 h，TBST 洗膜3次，每次15 min ；加入用 TBST 1∶20 000 稀釋的His 二抗，37℃ 孵育1 h，TBST 洗膜3次，每次15 min；HRP-DAB 底物顯色試劑盒顯色，用 Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5 褶牡蠣金屬硫蛋白HPLC檢測

將取出的菌液7 000 r/min 10min收集菌液，于80℃下水浴5 min，12 000 rpm/min 離心10 min，后取上清。

MT含量測定：取MT上清液20 μL，依次加入20%(W/V)TCEP溶液3 μL、5 mg/mL的SBD-F溶液10 μL及反應(yīng)緩沖液(1 mol/L硼酸、30 mmol/L EDTA、0.8 mol/L KOH，pH 10.5)75 μL，震蕩混勻，于50℃下水浴反應(yīng)30 min，反應(yīng)完成后加入HCl(4 mol/L)10 μL終止反應(yīng)，然后用20 mmol/L定容緩沖液(pH 7.5)定容至1 mL，旋渦震蕩混勻，過0.22 μm水系膜后上HPLC進行MT含量測定。采用HPLC方法測定其中-SH含量以進行MT間接定量[23]。

色譜條件：流動相為乙腈∶磷酸緩沖液(25 mmol/L，pH=7.5)∶甲醇=18∶80∶2，色譜柱：ODS-BP(填料：Sinochrom，4.6 mm×250 mm，5 μm)C18柱；進樣量：40 μL；洗脫時間：20 min；流速：0.5 mL/min；柱溫：25℃；激發(fā)波長380 nm，發(fā)射波長510 nm。圖6(A)為色譜條件下得到的兔肝MT標樣色譜圖，MT保留時間為7.3～7.7 min。

1.2.6 融合蛋白活性檢測

配置50、100、200、500、700 μmol/L的CdCl2工作液各100 μl，分別將其涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，待其完全吸收后，取100 μL OD600為4.0的枯草芽孢桿菌重組Op-MT工程菌均勻涂布于上述平板上，同時以枯草芽孢桿菌WB800N菌株為對照組，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h觀察菌落生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增Op-MT及分泌表達載體的構(gòu)建

以褶牡蠣內(nèi)臟團總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的DNA為模板，PCR擴增得到目的基因Op-MT與預(yù)計大小相符(約為324 bp)，見圖2。用BamHI/SmaI分別雙酶切此PCR產(chǎn)物和分泌表達載體pHT43后用連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT43-SUMO-Op-MT。該質(zhì)粒的酶切驗證見圖2。酶切片段大小約為660 bp，與預(yù)期相符，此片段為目的基因SUMO-Op-MT。

注：左為PCR擴增SUMO-Op-MT基因；M：DNA Marker；1：SUMO-Op-MT擴增產(chǎn)物。右為SUMO-Op-MT表達載體的酶切圖；M：DNA Marker；2：表達質(zhì)粒雙酶切。

Notes：Amplification of SUMO-Op-MT gene by PCR(left)；M：DNA Marker；1：Gene of SUMO-Op-MT.Restrictive enzyme digestion of SUMO-Op-MT(right)；M：DNA Marker；2：Restrictive enzyme digestion of SUMO-Op-MT.

2.2 高效分泌表達 Op-MT 重組工程菌篩選

將重組質(zhì)粒 pHT43-SUMO-Op-MT 運用化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800N，經(jīng)過氯霉素和新霉素抗性篩選、PCR鑒定，得到一株高效表達Op-MT的枯草桿菌工程菌B.subtilisWB800N/pHT43-SUMO-Op-MT，見圖3。

注：A：陰性對照；B：枯草芽孢桿菌WB800N對照；C：重組WB800N-MT枯草芽孢桿菌工程菌；D：枯草芽孢桿菌WB800N對照。

Notes：A：Negative control;B：Control of WB800N bacteria;C：Recombinant bacteria of WB800N-MT;D：Control of WB800N bacteria.

2.3 重組蛋白的誘導表達、分離純化和Western blotting 鑒定

100 mL WB800N/ pHT43-SUMO-Op-MT菌液擴大誘導培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃，4 h，1 mmol/L IPTG。2、4 h分別離心(12 000 r/min，4℃，30 min)收集發(fā)酵液上清，進行SDS-PAGE 電泳分析。以未轉(zhuǎn)入表達載體的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液為空白對照(圖 4)。分析圖4發(fā)現(xiàn)在 23 kD(其中Op-MT編碼蛋白大小為10.5 kD)位置出現(xiàn)了一條明顯的特異性條帶，且融合蛋白為可溶形式表達。

利用 His-tag 標簽親和純化 SUMO-Op-MT 融合蛋白，并用含 500 mmol/L 咪唑、pH 8.0 TBS 洗脫液進行洗脫。收集洗脫峰并進行12% SDS-PAGE 凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，洗脫液中含有分子量約為 23 kD 的目的條帶(圖 4)。Bradford method 分析結(jié)果表明，蛋白純度在 95% 以上(圖 4)(目的蛋白得率0.436 mg/mL)。然后將純化后的目的蛋白進行 Western blotting 鑒定，結(jié)果顯示融合蛋白能與 His-Tag 單克隆抗體產(chǎn)生陽性反應(yīng)(圖 5)，且與SDS-PAGE 中 SUMO-Op-MT 融合蛋白的位置相符，說明融合蛋白在宿主菌中得到了表達。

注：M：虹彩蛋白 Marker；?：未轉(zhuǎn)化(陰性對照)；紅色箭頭為目的蛋白。

Notes：M：Protein Marker;?：Non-transfector(negative control);Red arrowhead：Target protein.

2.4 重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中Op-MT的HPLC檢測

以兔肝MT為標樣，兔肝MT標品(0.1 mg/mL)和枯草芽孢桿菌重組工程菌發(fā)酵液HPLC結(jié)果見圖6。兔肝MT目的峰的保留時間為7.3～7.7 min。結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌重組工程菌發(fā)酵液在7.7 min有峰出現(xiàn)，說明枯草芽孢桿菌重組工程菌發(fā)酵液中含有目的蛋白，枯草芽孢桿菌重組工程菌成功表達了目的蛋白Op-MT，表達量為0.13 mg/mL。

注：M：蛋白 Marker；+.陽性對照。

Notes：M：Protein Marker;+：Positive control.

2.5 褶牡蠣金屬硫蛋白的活性檢測

將含有SUMO-Op-MT質(zhì)粒的重組枯草芽孢桿菌工程菌和不含SUMO-Op-MT質(zhì)粒的空載體枯草芽孢桿菌空載體分別涂布于含有CdCl2的培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16 h后發(fā)現(xiàn)(圖7)，在濃度為50 μmol/L的CdCl2平板上，空載體的菌落少于含有MT的重組工程菌；當CdCl2濃度達到100 μmol/L時，MT重組工程菌生長較差，而空載體平板上未能檢測到菌落；說明含有SUMO-Op-MT的重組枯草芽孢桿菌工程菌對重金屬鎘耐受能力增強。但是當CdCl2濃度達到200 μmol/L及以上時，兩種菌落都未能被檢測到，說明在高濃度CdCl2脅迫下金屬硫蛋白活性受到了抑制。

3 討論

目前，國內(nèi)對MT的基因工程方面研究大多集中在大腸桿菌表達系統(tǒng)和微生物MT解毒，對MT工業(yè)化應(yīng)用關(guān)注較少，具有工業(yè)化生產(chǎn)價值的基因工程菌株報道更是極少。近年來，國內(nèi)外學者針對MT大腸桿菌表達系統(tǒng)研究做了大量工作，取得了較大進展，但E.coli直接表達MT，其表達量極低，通常需使用同位素標記才能檢測到[24-26]，或因形成大量無生物活性的包涵體，而復(fù)性效果不明顯[27-30]。本課題組前期研究也證實盡管大腸桿菌(E.coli)直接表達MT也能高效表達，但是表達的蛋白仍以包涵體的形式存在。

枯草芽孢桿菌作為宿主菌，具有表達和分泌活性蛋白、直接將表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中、不分泌內(nèi)毒素、其發(fā)酵產(chǎn)物可直接用于食品生產(chǎn)中等優(yōu)點，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。隨著研究的不斷深入及對芽孢桿菌的多種特性的揭示，芽孢桿菌的研究已在多種領(lǐng)域開展[31]，并利用枯草芽孢桿菌實現(xiàn)了某些外源基因的表達[32-35]，且所表達的蛋白保留原有的生物學活性[36]，但尚未見利用枯草芽孢桿菌實現(xiàn)海洋源MT的報道。本研究運用八種蛋白酶缺陷的枯草芽孢桿菌WB800N作為宿主，實現(xiàn)SUMO(Small ubiquitin-related modifier)與海洋源MT在枯草芽孢桿菌WB800N中融合表達，得到可溶性目的蛋白，成功實現(xiàn)了海洋源金屬硫蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌表達，并獲得具有活性的海洋源金屬硫蛋白，為解決制約MT產(chǎn)業(yè)發(fā)展原料來源瓶頸、開發(fā)天然高效海洋源重金屬生物解毒劑提供理論依據(jù)，也為實現(xiàn)海洋源MT的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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