靳愛軍，胡凌飛，張柯，杜濤，劉波波，李勁松，李娜

近年來，由于新發(fā)再發(fā)傳染病如 SARS、甲型H1N1 流感、結(jié)核、埃博拉等高致病性空氣傳播傳染病的暴發(fā)[1-3]，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)日益頻繁，實(shí)驗(yàn)室安全風(fēng)險(xiǎn)也極大增加。生物安全三級(jí)（biosafety level 3，BSL-3）實(shí)驗(yàn)室是為開展與第二類病原微生物相關(guān)的實(shí)驗(yàn)而設(shè)計(jì)建造的，其中氣溶膠的形成與傳播是造成生物污染與人員感染的最主要途徑[4]，對(duì)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)與意外事故產(chǎn)生的氣溶膠進(jìn)行定量研究是實(shí)驗(yàn)室生物污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要內(nèi)容。本文對(duì)BSL-3 實(shí)驗(yàn)室中 6 種實(shí)驗(yàn)活動(dòng)意外事故產(chǎn)生的氣溶膠進(jìn)行定量研究，分析造成的生物污染風(fēng)險(xiǎn)，為實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及相應(yīng)的人員防護(hù)措施等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粘質(zhì)沙雷菌（8039）為軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所保藏；大腸埃希菌（ATCC 13706）及其噬菌體 ΦX174（ATCC 13706-B1）購(gòu)于 ATCC 菌種保藏中心。采用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)。Andersen 空氣微生物采樣器購(gòu)自青島眾瑞智能儀器有限公司；0.85% 生理鹽水采樣管購(gòu)自友康恒業(yè)生物科技（北京）有限公司。一次性環(huán)氧乙烷滅菌培養(yǎng)皿（直徑 90 mm，傾注普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）。

1.2 方法

本研究模擬的實(shí)驗(yàn)操作均在正常運(yùn)行的BSL-3 實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜外進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程保持溫度 26 ℃，濕度 76%，壓力 –93 Pa。每次實(shí)驗(yàn)操作之前首先使用 Andersen 二級(jí)空氣微生物采樣器對(duì)環(huán)境本底進(jìn)行采樣，作為空白對(duì)照，以確定環(huán)境中是否存在替代微生物。

實(shí)驗(yàn)中粘質(zhì)沙雷菌的濃度為 4.68 × 109CFU/ml和 4.68 × 107CFU/ml，噬菌體 ΦX174 的濃度為1.32 × 108PFU/ml 和 1.32 × 107PFU/ml。表面采樣使用無菌棉拭子蘸取滅菌生理鹽水在采樣表面均勻涂抹 5 cm × 5 cm 的方形區(qū)域 5 次[5]，將采樣后的拭子放入生理鹽水管中，充分混勻振蕩使采集到的微生物充分釋放。吸取 1 ml 的采樣液直接滴加至平皿中充分混勻，然后對(duì)采樣平皿進(jìn)行培養(yǎng)。每平方厘米的微生物數(shù)為 M = N·F·D/A，其中 N 為平皿培養(yǎng)之后的菌落數(shù)（或噬菌斑數(shù)）；F 為采樣管內(nèi)液體總體積；D 為稀釋倍數(shù)；A 為采樣涂抹面積。每次實(shí)驗(yàn)后噴灑 75% 的酒精溶液和紫外燈徹底消毒滅菌。

1.2.1 吹吸混勻產(chǎn)生氣溶膠 將 1 ml 替代微生物培養(yǎng)液置于 2 ml 離心管中，1 名操作人員使用移液槍反復(fù)吹吸混勻，操作 15 min。5 min 時(shí)使用Andersen 六級(jí)采樣器和沉降平皿分別進(jìn)行采樣。采樣布置如圖 1A 所示。以實(shí)驗(yàn)過程中移液槍和離心管的位置為圓心擺放 3 個(gè)六級(jí)采樣器，半徑為0.2 m，采樣時(shí)間 10 min。在相同的圓周的上半圓均勻擺放 6 個(gè)沉降平皿，沉降 20 min。結(jié)束后在操作區(qū)表面半徑 0.2 m 的圓內(nèi)選取三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行表面采樣。更換不同濃度的微生物培養(yǎng)液重復(fù)上述操作。

圖1 6 種實(shí)驗(yàn)操作及意外事故產(chǎn)生氣溶膠的采樣示意圖（A：吹吸混勻；B：離心時(shí)離心管破裂；C：超聲裂解；D：培養(yǎng)瓶意外跌落；E：凍干粉意外灑落；F：注射攻毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)意外噴出）Figure 1 Diagrammatic sketches of aerosols sampling in 6 kinds of experiments and accidents (A: Mix-up; B: Centrifugation with broken tubes; C: Ultrasonic cleavage; D: Accidental fall-off of culture flask; E: Accidental spattering of lyophilized powder; F:Accidental gush of liquid from the syringe)

1.2.2 離心時(shí)離心管破裂產(chǎn)生氣溶膠 將 15 ml粘質(zhì)沙雷菌液裝入 50 ml 離心管中，將離心管塑料蓋中央剪開一直徑 3 mm 的孔，模擬離心時(shí)離心管破裂的意外事故，放入離心機(jī)中在溫度 4 ℃、轉(zhuǎn)速12000 r/min 的條件下離心 10 min。采樣布置如圖1B 所示。離心機(jī)周圍放置 3 個(gè) Andersen 六級(jí)采樣器，離心開始同步進(jìn)行采樣，離心結(jié)束打開保護(hù)罩之后繼續(xù)采樣 5 min。離心機(jī)周圍擺放 6 個(gè)沉降平皿，沉降 20 min。氣溶膠采樣結(jié)束后在離心機(jī)周圍選取 3 個(gè)位置進(jìn)行表面采樣。更換不同濃度的微生物培養(yǎng)液重復(fù)上述操作。

1.2.3 超聲裂解產(chǎn)生氣溶膠 濃度為 4.68 ×109CFU/ml 的粘質(zhì)沙雷菌液裝在 2 ml 離心管中超聲裂解 5 min。采樣布置如圖 1C 所示。在超聲破碎儀腔室正對(duì)位置對(duì)稱擺放 2 個(gè) Andersen 六級(jí)采樣器和 4 個(gè)沉降平皿，超聲裂解的同時(shí)開啟進(jìn)行采樣，Andersen 采樣時(shí)間 5 min，沉降 20 min。完成超聲裂解后在操作區(qū)臺(tái)面選取 3 個(gè)位置進(jìn)行表面采樣。更換不同濃度的微生物培養(yǎng)液重復(fù)上述操作。

1.2.4 培養(yǎng)瓶意外跌落產(chǎn)生氣溶膠 將微生物培養(yǎng)液 30 ml 裝入三角瓶中，從實(shí)驗(yàn)人員手中意外跌落。采樣布置如圖 1D 所示。距離跌落點(diǎn) 1 m 的圓周上均勻擺放 3 個(gè) Andersen 六級(jí)采樣器，采樣時(shí)間 10 min。四周擺放 13 個(gè)沉降平皿，沉降20 min。更換不同濃度的微生物培養(yǎng)液重復(fù)上述操作。

1.2.5 凍干粉意外灑落產(chǎn)生氣溶膠 將替代微生物培養(yǎng)液冷凍干燥制成粉末分裝于小三角瓶?jī)?nèi)，每個(gè)裝 0.4 g，從操作者手中掉落到地板上，粉末灑出。采樣布置如圖 1E 所示。距離灑落點(diǎn) 1 m的圓周上均勻放置 3 個(gè)六級(jí)采樣器，采樣時(shí)間5 min。同時(shí)在灑落點(diǎn)周圍擺放 13 個(gè)沉降平皿，沉降 20 min。更換凍干粉重復(fù)上述操作。

1.2.6 注射攻毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)意外噴出產(chǎn)生氣溶膠 注射器中吸取 0.2 ml 微生物培養(yǎng)液，模擬攻毒液從注射器中噴出到環(huán)境中的意外事故。采樣布置如圖 1F 所示。在距離操作點(diǎn) 0.1 m 處均勻放置3 個(gè) Andersen 六級(jí)采樣器，同時(shí)開始采樣，采樣時(shí)間 5 min。在四周擺放 6 個(gè)沉降平皿，沉降20 min。更換不同濃度的微生物培養(yǎng)液重復(fù)上述操作。

1.3 替代微生物采樣平皿的培養(yǎng)與氣溶膠濃度的計(jì)算

粘質(zhì)沙雷菌采樣平皿 30 ℃ 恒溫培養(yǎng) 24 h，計(jì)數(shù)每個(gè)平皿的菌落數(shù)。噬菌體 ΦX174 采樣平皿倒上層后 37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 24 h，計(jì)數(shù)每個(gè)平皿的噬菌斑數(shù)。

Andersen 六級(jí)采樣器的采樣流量為 28.3 L/min，采樣平皿按照文獻(xiàn)[6]校正后的菌落數(shù)（或嗜菌斑數(shù)）及采樣流量計(jì)算空氣中的微生物氣溶膠濃度。

微生物氣溶膠濃度[7]：C = 5000·N/(A·t)，式中C 為微生物氣溶膠濃度（CFU/m3或 PFU/m3）；N 為沉降平皿上生長(zhǎng)的菌落數(shù)（或噬菌斑數(shù)）；A 為平皿面積（cm2）；t 為采樣時(shí)間（min）。

2 結(jié)果

2.1 吹吸混勻產(chǎn)生氣溶膠

吹吸混勻過程產(chǎn)生的氣溶膠濃度見表 1 和表 2，Andersen 采樣器②采集到的微生物氣溶膠濃度最高，說明實(shí)驗(yàn)人員操作過程中，在其正面產(chǎn)生的氣溶膠濃度最高。對(duì)操作區(qū)表面采樣的結(jié)果均為 0。

2.2 離心時(shí)離心管破裂產(chǎn)生氣溶膠

離心管破裂條件下進(jìn)行離心時(shí)，產(chǎn)生的氣溶膠濃度見表 3 和表 4，微生物氣溶膠的最高檢測(cè)濃度為 16 CFU/m3。對(duì)操作區(qū)表面采樣的結(jié)果均為 0。

2.3 超聲裂解產(chǎn)生氣溶膠

超聲裂解時(shí)產(chǎn)生的氣溶膠濃度見表 5，采樣的最高氣溶膠濃度為 92 CFU/m3。對(duì)操作區(qū)表面采樣的結(jié)果為 0。

表1 吹吸混勻產(chǎn)生氣溶膠濃度-Andersen 采樣結(jié)果Table 1 Concentrations of aerosols generated in the process of mix-up-results of the Andersen sampling

表2 吹吸混勻產(chǎn)生氣溶膠濃度-沉降法采樣結(jié)果Table 2 Concentrations of aerosols generated in the process of mix-up - results of the settling sampling

表3 離心時(shí)離心管破裂產(chǎn)生氣溶膠濃度-Andersen 采樣結(jié)果Table 3 Concentrations of aerosols generated in the process of centrifugation with broken tubes - results of the Andersen sampling

表4 離心時(shí)離心管破裂產(chǎn)生氣溶膠濃度-沉降法采樣結(jié)果Table 4 Concentrations of aerosols generated in the process of centrifugation with broken tubes - results of the settling sampling

表5 超聲裂解產(chǎn)生氣溶膠濃度Table 5 Concentrations of aerosols generated in the process of ultrasonic cleavage

2.4 培養(yǎng)瓶意外跌落產(chǎn)生氣溶膠

培養(yǎng)瓶意外跌落產(chǎn)生的氣溶膠濃度見表 6 和表 7，采樣最高值為 1576 CFU/m3。且 Andersen 與沉降法采樣結(jié)果的分布一致。

2.5 凍干粉意外灑落產(chǎn)生氣溶膠

替代微生物凍干粉意外灑落產(chǎn)生的氣溶膠濃度見表 8 和表 9，采樣最高值為 1618 PFU/m3。與 2.4 所示結(jié)果相反，噬菌體 ΦX174 凍干粉產(chǎn)生的氣溶膠濃度遠(yuǎn)高于粘質(zhì)沙雷菌凍干粉意外灑落的結(jié)果，這可能是凍干粉中微生物含量不一致的影響。

2.6 注射攻毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)意外噴出產(chǎn)生氣溶膠

注射時(shí)意外噴出至環(huán)境中產(chǎn)生的氣溶膠濃度見表 10 和表 11，采樣最高值達(dá) 27336 CFU/m3。

表6 培養(yǎng)瓶意外跌落產(chǎn)生氣溶膠濃度-Andersen 采樣結(jié)果Table 6 Concentrations of aerosols generated when the culture flask fell off accidently-results of the Andersen sampling

表7 培養(yǎng)瓶意外跌落產(chǎn)生氣溶膠濃度-沉降法采樣結(jié)果Table 7 Concentrations of aerosols generated when the culture flask fell off accidently-results of the settling sampling

表8 凍干粉意外灑落產(chǎn)生氣溶膠濃度-Andersen 采樣結(jié)果Table 8 Concentrations of aerosols generated when the lyophilized powder spattered accidently-results of the Andersen sampling

表9 凍干粉意外灑落產(chǎn)生氣溶膠濃度-沉降法采樣結(jié)果Table 9 Concentrations of aerosols generated when the lyophilized powder spattered accidently-results of the settling sampling

表10 注射攻毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)意外噴出產(chǎn)生氣溶膠濃度-Andersen 采樣結(jié)果Table 10 Concentrations of aerosols generated during the accidental gush of liquids from syringe-results of the Andersen sampling

表11 注射攻毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)意外噴出產(chǎn)生氣溶膠濃度-沉降法采樣結(jié)果Table 11 Concentrations of aerosols generated during the accidental gush of liquids from syringe-results of the settling sampling

3 討論

實(shí)驗(yàn)室中的各種實(shí)驗(yàn)活動(dòng)和意外事故均會(huì)產(chǎn)生不同濃度的微生物氣溶膠，根據(jù)參考文獻(xiàn)[8-10]，產(chǎn)生的氣溶膠濃度注射攻毒時(shí)意外噴出約104CFU/m3，培養(yǎng)瓶意外墜落和凍干粉意外灑落約103CFU/m3（PFU/m3），吹吸混勻、離心時(shí)離心管破裂及超聲裂解均為 10 ～ 100 CFU/m3（PFU/m3）。本文在 BSL-3 實(shí)驗(yàn)室中的研究結(jié)果與之一致，說明 BSL-3 實(shí)驗(yàn)室中各種實(shí)驗(yàn)活動(dòng)和意外事故時(shí)產(chǎn)生的微生物氣溶膠不能忽視。

不同實(shí)驗(yàn)活動(dòng)產(chǎn)生不同濃度的微生物氣溶膠，并且產(chǎn)生的氣溶膠粒子大小也不同。據(jù) Kenny 和Sabel[11]的研究，凍干粉意外灑落產(chǎn)生氣溶膠的粒徑大于 5 μm，其他實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的粒徑則小于 5 μm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示吹吸混勻、離心時(shí)離心管破裂及超聲裂解產(chǎn)生的氣溶膠濃度較低，但其粒徑小于 5 μm，會(huì)在空氣中長(zhǎng)時(shí)間懸浮，并且一旦被吸入到達(dá)人體肺深部的概率更大，因此對(duì)環(huán)境的污染及人員感染的風(fēng)險(xiǎn)不可小覷。氣溶膠粒子粒徑越小，其沉降速度越慢，使用沉降平皿采集到的粒子數(shù)較 Andersen空氣采樣的結(jié)果少，這與本文所述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

環(huán)境濕度對(duì)氣溶膠粒子的影響也很顯著。當(dāng)環(huán)境比較干燥時(shí)，氣溶膠粒子攜帶的水分蒸發(fā)較快，從而使粒子變小，更易長(zhǎng)時(shí)間懸浮于空氣中，不易沉降；而當(dāng)環(huán)境濕度較高時(shí)，氣溶膠粒子作為凝結(jié)核易于吸收更多水分變大甚至發(fā)生團(tuán)聚，從而沉降速度加快。BSL-3 實(shí)驗(yàn)室具有獨(dú)立的通風(fēng)循環(huán)系統(tǒng)，微生物氣溶膠會(huì)隨著氣流在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)漂浮，實(shí)驗(yàn)人員活動(dòng)也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的氣流，降低氣溶膠粒子沉降速度，增加感染的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，在 BSL-3 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)活動(dòng)時(shí)，微生物氣溶膠的感染風(fēng)險(xiǎn)需要引起高度重視，做好個(gè)人防護(hù)，對(duì)呼吸道防護(hù)裝備的使用應(yīng)測(cè)試面型密合度，以最大程度地降低或消除實(shí)驗(yàn)活動(dòng)及意外事故引起的人員感染。

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