黃立綱，劉煉華，劉航齊，賈玫

心血管疾病已經(jīng)成為全球全因死亡的首要病因，且呈逐年上漲的趨勢，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是其病理基礎(chǔ)。Lp-PLA2 是近年來引起廣泛關(guān)注的磷脂酶超家族成員，與心血管疾病密切相關(guān)，被認為是冠心?。╟oronary artery disease，CAD）獨立的風(fēng)險預(yù)測因子[1]，大量研究表明 Lp-PLA2 可促進 AS 發(fā)展，為診斷及預(yù)防心血管事件的發(fā)生提供了新的手段。

Kolodgie 等[2]在冠狀動脈事件猝死患者尸檢解剖中發(fā)現(xiàn)，在壞死中心巨噬細胞易損和破裂斑塊的周圍 Lp-PLA2 高表達，損害較輕的脂質(zhì)池Lp-PLA2 水平較低，可見隨著斑塊的進程，斑塊組織中 Lp-PLA2 表達逐漸升高。朱雁洲等[3]通過檢測急性冠狀動脈綜合征患者、穩(wěn)定型心絞痛患者和排除冠心病者的 Lp-PLA2 水平和血管內(nèi)超聲虛擬組織學(xué)（intravascular ultrasoundvirtual histology，IVUS-VH）冠狀動脈斑塊特征也得出相似結(jié)論，可見 Lp-PLA2 在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中的重要作用，且與斑塊的性質(zhì)相關(guān)。

載脂蛋白 E（apolipoprotein E，ApoE）是血漿脂蛋白的重要成分，對脂質(zhì)的運輸和代謝發(fā)揮主要作用，在 AS 的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。ApoE 基因缺陷小鼠可自發(fā)形成 AS 病變，與在人體內(nèi)的發(fā)展過程極為相似[4]。利用該模型觀測 AS進展過程中各種炎癥因子的濃度變化及作用和Lp-PLA2 在組織中的分布變化，可為臨床早期 AS的預(yù)防、診斷及病情評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 主要儀器 LST008 全自動生化分析儀由日本 Hitachi 公司生產(chǎn)；伯樂 680 酶標儀由美國Bio-Rad 公司生產(chǎn)。

1.1.2 主要試劑 ApoE 基因敲除小鼠、高脂飼料由北京華阜康生物科技有限公司提供；TC 酶法檢測試劑盒、TG 酶法檢測試劑盒均由美國 Beckman Coulter 公司提供；HCY 循環(huán)酶法檢測試劑盒由北京柏定生物工程有限公司提供；Lp-PLA2 活性測定試劑盒由德國 DiaSys 公司提供；抗小鼠 CRP ELISA 方法試劑盒、抗小鼠 IL-6 ELISA 試劑盒由美國 R&D 公司提供；兔抗小鼠 Lp-PLA2 單克隆抗體由美國 Proteintech 公司提供；免疫組化二抗試劑盒由上海基因科技有限公司提供；山羊血清原液由北京索萊寶科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)方案 參照文獻[4]，設(shè)計動物飼養(yǎng)方案。6 周齡 ApoE 基因缺陷小鼠（品系C57BL/6J）55 只，全部為雄性，飼養(yǎng)于無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級、免疫缺陷動物專用飼養(yǎng)間。每籠 5 只小鼠，飼料、飲水供應(yīng)充足。隨機選取 45 只做實驗組，飼以含脂肪21%、膽固醇 0.15%（以重量計）的高脂飼料（滅菌照射處理）；其余 10 只為對照組，飼以一般飼料，小鼠均為自由采食。

1.2.2 AS 的觀察 自第20 周（周齡）起，每隔2 周隨機選取 2 只實驗組小鼠，面靜脈取血約1 ml 至 EP 管，隨后斷頸處死，解剖暴露心臟。磷酸鹽緩沖液（PBS）灌注洗去血管中的血細胞，隨后注入 4% 甲醛固定液，小心剝離主動脈。進行石蠟包埋，切片厚度為 4 μm，蘇木精伊紅（HE）染色，觀察主動脈根部及主動脈弓小彎處等好發(fā)部位AS 斑塊形成情況。在鏡下觀察到脂質(zhì)核形成時判定 AS 模型建立成功，自此每周選取 3 只實驗組小鼠、每隔 3 周選取 3 只對照組小鼠，取血并斷頸處死取主動脈，做石蠟包埋抗 Lp-PLA2 免疫組織化學(xué)（IHC）染色。實驗期間每天觀察小鼠生理狀況，如有意外死亡小鼠盡快解剖分析其死亡原因與 AS 的關(guān)系。

1.2.3 血脂及炎癥因子水平分析 血標本離心分離血清，膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、同型半胱氨酸（HCY）、Lp-PLA2 使用全自動生化分析儀檢測?？剐∈?C 反應(yīng)蛋白（CRP）以及抗小鼠白細胞介素-6（IL-6）使用酶標儀檢測。分析各項標志物隨 AS 進程的變化趨勢并比較同一時間段實驗組與對照組的差異。

1.2.4 IHC 染色 自第27 周起每周選取 3 只實驗組小鼠、每隔 3 周選取 3 只對照組小鼠，取血并斷頸處死，取主動脈，做石蠟切片兔抗小鼠Lp-PLA2 單克隆抗體免疫組化染色，3% 過氧化氫溶液阻斷內(nèi)生過氧化氫酶，5% ～ 10% 山羊血清封閉，抗體稀釋度為 1:50，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，鏡下觀察 Lp-PLA2 在血管組織中的分布，探究 AS 不同時期 Lp-PLA2 在組織中的作用。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計分析，計量資料采用單樣本的 K-S 檢驗分別進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)性檢驗的計量資料采用±s的形式進行描述。組間資料比較采用獨立樣本t檢驗，生物標志物與 AS 的相關(guān)性采用多重線性回歸分析評價。所有檢驗以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。生物標志物隨時間變化曲線圖采用 GraphPad Prism 5 軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 AS 模型的建立

實驗組小鼠共 45 只，飼養(yǎng)第4 周、第14 周、第24 周各出現(xiàn) 1 只小鼠死亡，可見外傷，大中動脈未見明顯栓塞；主動脈 HE 染色鏡下可見血管內(nèi)皮下脂質(zhì)核初步形成（24 周），但未見明顯的纖維帽形成，由此判斷死亡原因可能由同籠斗毆造成，與 AS 無關(guān)。

利用實驗組小鼠做 HE 主動脈染色觀測 AS斑塊形成情況。實驗組小鼠在第20 周齡時觀測到血管內(nèi)皮組織下泡沫細胞形成；26 周齡時可見脂質(zhì)核形成，AS 模型建立成功[4]；30 周齡時白細胞繼續(xù)聚集、脂質(zhì)持續(xù)堆積、纖維帽形成；36 周齡時纖維帽明顯變薄。實驗組各時期 HE 染色鏡下觀察結(jié)果如圖 1。

2.2 血清學(xué)檢測

各項生物標志物隨實驗組小鼠周齡的變化如圖 2，可見 Lp-PLA2 隨時間變化呈上升趨勢，其余生物標志物隨時間變化趨勢不明顯。

2.2.1 實驗組及對照組的比較 選取與對照組同期的 10 組實驗組小鼠數(shù)據(jù)，比較兩組小鼠各生物標志物的水平（表 1）。各項指標均成正態(tài)分布，獨立樣本t檢驗顯示實驗組 Lp-PLA2 水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），而其余指標均無統(tǒng)計學(xué)差異（P〉 0.05），提示在各項生物標志物中，Lp-PLA2 隨 AS 進展變化更明顯。

2.2.2 回歸分析 簡單線性回歸分析顯示Lp-PLA2 與周齡相關(guān)（P＜ 0.001），體重及其他生物標志物與周齡不成線性關(guān)系（P〉 0.05）。Lp-PLA2的回歸方程為 Y = 99.763x + 313.155（r2= 0.937），與周齡即 AS 進程相關(guān)性較好。以周齡為應(yīng)變量（Y），體重、CHO、TG、HCY、Lp-PLA2、CRP 以及 IL-6 為自變量（xi），用逐步法進行多重線性回歸分析，剔除了體重、CHO、HCY、CRP 及 IL-6 等自變量，得出方程 Y = 0.011xLp-PLA2– 2.214xTG–2.147（r2= 0.989，P＜ 0.001），擬合程度較高，但共線性診斷結(jié)果顯示 Lp-PLA2 存在共線性，因此采用嶺回歸分析。取 k = 0.26 時的回歸系數(shù)，得出方程 Y = 0.767778xLp-PLA2+ 0.000594xTG（r2=0.89658）。

圖1 HE 染色鏡下實驗組小鼠各時期 AS 斑塊形態(tài)（× 40）（A：20 周齡時為 AS 早期，可見白細胞進入到血管內(nèi)皮下，形成泡沫細胞；B：26 周齡時血管皮下脂質(zhì)堆積，脂質(zhì)核初步形成；C：30 周齡時脂質(zhì)核擴大、纖維帽形成；D：36 周齡時脂質(zhì)核進一步擴大，纖維帽明顯變薄，血管腔隙變小）Figure 1 The atherosclerosis plaque morphology of experimental mice in different stages microscopically, HE staining (× 40) (A:20 week-phase, early atherosclerosis, the leukocyte enter the vascular endothelium, turn into foam cells; B: 26 week-phase, the accumulation of lipid under the vascular endothelium, the lipid nucleus was initially formed; C: 30 week-phase, the lipid nucleus expanded, the fiber cap formed; D: 36 week-phase, the lipid nucleus further expanded, the fiber cap turn thin, the vascular cavity is smaller)

圖2 實驗組生物標志物隨時間變化曲線圖Figure 2 The biomarkers of the experimental group changed over time

表1 對照組及實驗組各生物標志物的比較（± s ）Table 1 Comparison of biomarkers in control group and experimental group (± s )

表1 對照組及實驗組各生物標志物的比較（± s ）Table 1 Comparison of biomarkers in control group and experimental group (± s )

變量 Variable 對照組（n = 10） Control group (n = 10) 實驗組（n = 10） Experimental group (n = 10) P 值 P value體重（g） Weight (g) 32.9 ± 2.2 40.1 ± 5.8 0.26 CHO（mmol/L） 13.95 ± 2.28 21.26 ± 2.53 0.665 TG（mmol/L） 1.355 ± 0.523 1.922 ± 0.845 0.151 HCY（μmol/L） 7.4 ± 1.2 7.1 ± 1.3 0.964 Lp-PLA2（U/L） 2193 ± 93 3895 ± 339 ＜ 0.05 CRP（μg/ml） 14.808 ± 2.431 15.298 ± 2.688 0.706 IL-6（pg/ml） 21.840 ± 22.917 64.345 ± 158.766 0.091

2.3 免疫組織化學(xué)染色

小鼠主動脈做抗 Lp-PLA2 IHC 染色，抗體稀釋度為 1:50。實驗組小鼠 20 周齡時為AS 早期，Lp-PLA2 少量分布在近血管內(nèi)皮的巨噬細胞核周（圖 3）。31 周齡時為 AS 中期，DAB 著色區(qū)域較 20 周齡時明顯擴大，Lp-PLA2 主要分布在血管內(nèi)皮下的巨噬細胞及脂質(zhì)核中心（圖 4）。37 周齡時為 AS 中后期，Lp-PLA2 更多分布在變薄的纖維帽下（圖 5）。喂養(yǎng)一般飼料的對照組小鼠，其主動脈 AS 斑塊內(nèi)抗 Lp-PLA2 的 DAB 著色明顯比實驗組較淺（圖 6）。

圖3 AS 早期（20 周齡實驗組小鼠），Lp-PLA2 隨與之結(jié)合的 LDL 進入血管內(nèi)皮下，并分布在巨噬細胞內(nèi)，細胞間 DAB 著色較淺（× 100）Figure 3 In the early stage of atherosclerosis (20 week-phase of experimental mice), Lp-PLA2 was combined with the LDL into the endothelium and distributed in macrophages, with a relatively shallow DAB between cells (× 100)

圖4 AS 中期（31 周齡實驗組小鼠）細胞間 DAB 著色加深，Lp-PLA2 主要分布在脂質(zhì)核中心（× 40）Figure 4 In the middle of atherosclerosis (31 week-phase of the experimental mice), DAB staining was enhanced, and Lp-PLA2 was mainly distributed in the lipid nucleus (× 40)

圖5 AS 中后期（37 周齡實驗組小鼠），Lp-PLA2 主要分布在變薄的纖維帽下（× 40）Figure 5 In the middle and late stage of atherosclerosis(37 week-phase of experimental mice), Lp-PLA2 was mainly distributed under the thinning fiber cap (× 40)

圖6 AS 進展中期（36 周齡對照組小鼠），纖維帽初步形成，DAB 著色較淺（× 40）Figure 6 In the middle stage of atherosclerosis (36 week-phase of control mice), the fiber cap was initially formed, and DAB was relatively light (× 40)

3 討論

多項研究證實 ApoE 基因缺陷小鼠的 AS 病變發(fā)展同人類極其相似，是適合用于研究人體 AS研究的動物模型。Nakashima 等[5]利用高脂喂養(yǎng)的ApoE 基因缺陷小鼠在 5 ～ 6 周齡就被觀察到單核細胞趨附，8 ～ 10 周齡時主動脈外觀可見脂紋形成，在 15 ～ 20 周齡時有纖維斑塊形成；Johnson 和Jackson[6]也利用其建立 AS 模型，飼養(yǎng)至斑塊破裂自然死亡，時長為（46 ± 3）周，為 AS 模型建立提供了參考依據(jù)。本實驗中的高脂喂養(yǎng) ApoE 基因敲除小鼠與上述模型相比病變發(fā)展較慢，是因為第8 周齡起才開始喂養(yǎng)高脂飲食（購入時 6 周齡 +1 周適應(yīng)期，共 7 周喂養(yǎng)一般飼料），且高脂飼料的配方存在一定差異。

有些學(xué)者認為 Lp-PLA2 在小鼠與人體內(nèi)結(jié)合的脂蛋白不同，因而在 AS 中發(fā)揮的作用亦不同[7-8]，但在本實驗中，Lp-PLA2 在小鼠模型中依舊表現(xiàn)出了與 AS 較好的相關(guān)性。ApoE 基因敲除小鼠無論是否高脂喂養(yǎng)都會自發(fā)形成嚴重的高脂血癥和 AS 斑塊，因此本實驗中的“周齡”可間接反映 AS 的進展情況，而對照組可看作是 AS 進展程度較低的小鼠。統(tǒng)計結(jié)果顯示，實驗組小鼠Lp-PLA2 顯著高于對照組，提示隨 AS 進展Lp-PLA2 升高明顯，臨床監(jiān)測到此指標的明顯升高可提示 AS 病變的生成。簡單線性回歸分析顯示Lp-PLA2 與周齡呈顯著的線性相關(guān)，而其余指標都不與周齡呈線性關(guān)系，提示 Lp-PLA2 與AS 的相關(guān)性要優(yōu)于其他指標，臨床檢測 Lp-PLA2 有助于對患者 AS 進展情況的把握。

進行多重線性回歸時體重、CHO、HCY、CRP及 IL-6 的P〉 0.05，回歸系數(shù)可能為零，不具有統(tǒng)計學(xué)意義，因此僅以 Lp-PLA2 及 TG 為自變量得出方程。但 TG 回歸系數(shù)為負數(shù)，不符合臨床常理，共線性診斷顯示 Lp-PLA2 的方差膨脹因子（variance inflation factor，VIF）值大于 10，存在共線性，改做嶺回歸分析[9]。分析結(jié)果顯示 k 值在0.2 ～ 0.3 時，方程基本穩(wěn)定。自 k = 0.26 起，TG 的回歸系數(shù)大于 0 符合常理，取此時的回歸系數(shù)，得出方程 Y = 0.767778xLp-PLA2+ 0.000594xTG（r2=0.89658）。

可利用以周齡即 AS 進程為 Y，Lp-PLA2 及TG 為 xi得出的方程準確判斷 AS 病變的進展時期，以本實驗建模過程為例，通過測定小鼠Lp-PLA2 及 TG 值，利用方程 Y = 0.767778xLp-PLA2+ 0.000594xTG計算周齡，所得結(jié)果 ＜ 19 則小鼠主動脈尚無 AS 斑塊形成，20 ～ 26 則處于 AS 早期（脂質(zhì)核形成），27 ～ 32 為 AS 中期（脂質(zhì)核擴大、纖維帽形成），33 ～ 37 為 AS 進展中后期（脂質(zhì)核進一步擴大、纖維帽變薄，有斑塊破裂風(fēng)險）。如果能夠觀測人體內(nèi)斑塊形成情況及相關(guān)標志物水平，建立用于人體 AS 模型的方程 Y = b1x1+ b2x2+ b3x3+ … + bnxn+ bn+1探討其間關(guān)系，那么僅做血清學(xué)檢測就可利用模型推斷病情，大大簡化臨床診斷 AS 的過程。根據(jù) Lp-PLA2 的生物學(xué)特性，以Lp-PLA2 作為治療靶點，進行相關(guān)藥物的研究也是今后研究的方向。

[1] Packard CJ, O'Reilly DS, Caslake MJ, et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2 as an independent predictor of coronary heart disease. West of Scotland Coronary Prevention Study Group. N Engl J Med, 2000, 343(16):1148-1155.

[2] Kolodgie FD, Burke AP, Skorija KS, et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2 protein expression in the natural progression of human coronary atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006,26(11):2523-2529.

[3] Zhu YZ, Chen LL, Luo YK, et al. The relation of virtual histological features of coronary atherosclerotic plaques and lipoprotein-associated phospholipase A2 and the clinical implications. J Clin Cardiol, 2010,26(4):287-290. (in Chinese)朱雁洲, 陳良龍, 羅育坤, 等. 脂蛋白相關(guān)磷脂酶 A2與血管內(nèi)超聲虛擬組織學(xué)斑塊特征的關(guān)系及臨床意義. 臨床心血管病雜志,2010, 26(4):287-290.

[4] Liu JG, Dong GJ, Shi DZ, et al. Pathological progress of apolipoprotein E-knockout mice and the influence of different diets on atherosclerosis progress. Chin J Arterioscler, 2005, 13(6):689-692. (in Chinese)劉劍剛, 董國菊, 史大卓, 等. 載脂蛋白E基因敲除小鼠不同周齡動脈粥樣硬化的病理變化. 中國動脈硬化雜志, 2005, 13(6):689-692.

[5] Nakashima Y, Plump AS, Raines EW, et al. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb, 1994, 14(1):133-140.

[6] Johnson JL, Jackson CL. Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse. Atherosclerosis, 2001, 154(2):399-406.

[7] Zhao L, Yao ST, Wang YW, et al. Effect of protein modification of high density lipoprotein on its antiatherogenic function. Chin J Arterioscler, 2014, 22(10):1067-1071. (in Chinese)趙莉, 姚樹桐, 王義圍, 等. 高密度脂蛋白蛋白成分修飾對其抗動脈粥樣硬化功能的影響. 中國動脈硬化雜志, 2014, 22(10):1067-1071.

[8] Yang QQ, Chen ML. Progress of animal experimental research on phospholipase A2 in cardiovascular diseases. Chin J Comp Med, 2014,24(12):55-61. (in Chinese)楊欽欽, 陳民利. 磷脂酶A2在心血管疾病動物實驗中的研究進展.中國比較醫(yī)學(xué), 2014, 24(12):55-61.

[9] Cule E, De lorio M. Ridge regression in prediction problems:automatic choice of the ridge parameter. Genet Epidemiol, 2013, 37(7):704-714.